菌种抗生素的抗性检查标准操作规程

合集下载

抗生素效价操作规程

抗生素效价标准操作程序

1、目的：

建立一个抗生素效价的标准操作程序

2、范围：

抗生素效价的检测相关工作

3、责任：

生测组检验员

4、内容：

4.1 仪器用具与试药

4.1.1 180℃干热灭菌2h：陶瓦盖20个；试管(30×200mm) 1支（依据菌液浓度方法而论）；镊子(23mm) 1把；100ml量筒1个（依据菌液浓度方法而论）；25ml量筒1个；锥形瓶1个；钢管80个；1ml吸管2根；大口5ml吸管2支；10ml移液管2根；碟子20个

4.1.2 121℃高压湿热灭菌20分钟：抗生素Ⅰ号培养基；工服；pH7.8磷酸缓冲液约；无菌水；烂烧杯3个（盛放有菌试管）；一次性塑胶手套。

4.2操作步骤

4.2.1对照品称量

4.2.1.1从对照品管理人员处领取一支硫酸庆大霉素标准品（200mg），因标准品刚从冰箱取出，需放置室温平衡30分钟，然后拿到称量室，用已稳定(早点打开电源就能稳定)的万分之一天平称。

4.2.1.2取一张滤纸（1／4）称出重量，然后清零，按“F”键把“g”转化为“mg”,小心加对照品，直至39.2mg，可以多称一点，也许会粘纸。把对照品轻轻倒入容量瓶，再复称一下称量纸，记录下来。

4.2.1.3称取量加无菌水在容量瓶颈部口径处冲洗，观察到对照品溶解后加无菌水至刻度，充分摇匀，放置在冰箱。

4.2.2 供试品称量

4.2.2.1 准备一个干净50ml容量瓶，口径上附一个小漏斗（漏斗口径尽量挑选大一点的，可使供试品快速落到容量瓶）。把上述装备放到已稳定的万分之一天平称出数据，然后清零。从干燥器中取出供试品，倒入一部分到研钵中，顺时针快速研细颗粒，颗粒易吸潮，称取速度一定要快。

抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：

1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

抗生素敏感试验操作流程及评分标准

一、引言

抗生素敏感试验是临床微生物学中的一项重要实验，用于检测细菌对不同抗生素的敏感性，从而为临床合理使用抗生素提供参考依据。本文将介绍抗生素敏感试验的操作流程及评分标准。

二、操作流程

1. 准备工作

在进行抗生素敏感试验之前，需要准备以下材料和设备：

- 特定培养基：选择适合目标细菌生长的培养基，如Mueller-Hinton 琼脂糖培养基。

- 抗生素纸片：选择常见的抗生素纸片，如青霉素、红霉素、氨苄西林等。

- 灼菌环：用于均匀涂布细菌悬液。

- 可调离心机：用于快速离心培养物。

2. 实验步骤

步骤一：制备细菌悬液

- 从培养基上挑取单一菌落，用无菌试管中的生理盐水或培养基悬浮液悬浮。

- 调整细菌悬液的浓度至0.5麦克法布（McFarland）浑浊度标准。

步骤二：涂布培养基

- 取一块新鲜琼脂糖培养基平板，使用灼菌环均匀涂布细菌悬液在培养基上，旋转均匀。

步骤三：贴药品纸片

- 使用无菌镊子，将不同抗生素纸片分别贴在培养基上，留出适当距离。

步骤四：离心培养基

- 将培养基离心2分钟，使纸片与培养基充分接触。

步骤五：培养

- 将培养基倒置孔朝下，置于恒温培养箱中，进行培养。

步骤六：观察结果

- 在培养基上观察并记录菌落生长情况，观察抗生素纸片所贴区域的菌落是否生长或抑制。

三、评分标准

根据抗生素敏感试验结果，可采用以下评分标准进行分析：

- 敏感（S）：菌落生长完全受抑制；

- 中度敏感（I）：菌落生长部分受抑制；

- 抵抗（R）：菌落生长正常，未受抑制。

根据不同抗生素和细菌的敏感性和抵抗性程度，结合实际临床经验，可将评分标准进一步细分。例如：

抗生素效价测定操作规程

抗生素效价测定操作规

程

1. 主题内容和适用范围

本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2. 引用标准

《中国药典》2010年版二部。 3. 术语

抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4. 操作技术（仪器与用具）

4.1 操作室：光线明亮，操作间分 a.一般操作间b 半无菌操作间。室温控制20-25℃。注意抗生素的污染。

4.2 双蝶：内径90mm 高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁

液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。

4.3 陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4 钢管：内径 6.0±0.1mm 高7.8±0.1mm 或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超

±0.05g.用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h 以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min 或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW 冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5 钢管放置器

4.6 恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃

4.7 灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml 、20ml ），用后立即置5%石碳酸或

QCA/QC-SOP-006

抗生素敏感试验操作规程

一、抗生素敏感试验原理:

抗生素敏感试验是测定抗生素或其它抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力，通常用扩散法或稀释法。

1、扩散法敏感试验:

有抗生素的纸片或药片贴在已接种试验菌的平板上，抗生素浓度梯度通过纸片上的抗生素的弥散作用而形成，距纸片一定范围内试验细菌的生长受到抑制，这种抑制生长与细菌敏感及其他诸因素相关。

2、稀释法敏感试验：

为了定量测定抗生素的活性，抗生素与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，以最低浓度抑制细菌生长的，称为最低抑菌浓度（MIC），然后将最低抑菌浓度与机体血清或体液中可获得浓度相比较，来确定恰当的临床治疗浓度。

（1）最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration。MIC）:抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml,mg/L。

（2）最低杀菌浓度（minimal bacteriacidal concentration，MBC）:抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。单位：μg/ml或U/ml，mg/L。

（3）MIC90：能抑制90%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC90。

（4）MIC50：能抑制50%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC50。

二、抗生素敏感试验的作用：

1、指导临床医生对各患者选择最佳抗生素。

2、在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。

三、抗生素敏感试验的临床意义：

1、敏感：表示被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗生素常用剂量而达到治疗的目的。

耐药性和菌种鉴定详细资料和操作步骤

法国BVT 菌种和耐药性鉴定诊断测试

法国BVT Speed Biogram 是一个专为兽医设计的菌种和耐药性鉴定诊断产品，以确定致病菌（包括酵母菌）。专用于检测狗和猫皮肤，尿道，耳道和细菌感染。

它同时可以进行药敏测试，让兽医可用适当的抗生素治疗，避免盲目使用抗生素，导致治疗无效。这项测试是直接取自液体或细胞样本。

１、直接地从样品获得抗菌谱。

２、把检测结果展示给宠物主人，可以用于支持兽医师的诊断结果，并能提高抗生素的使用效果。３、使用Speed Biogram可尽快了解致病菌，以及致病菌对抗生素的抗性，以决定对患者施用有效的抗生素。依据抗药型给予患者最有利的治疗方式，可减少盲目抗生素（broad-spectrum antibiotic）的使用，进而减少可能产生的抗药性，避免治疗失败。

法国BVT Speed Biogram 可以在24小时- 48小时内对以下:

●13种抗生素的耐药性

●6种病原体菌种(pathogen bacteria)

●2种酵母菌(yeast) – Malassezia / Candida

进行鉴定，从而得出最佳的治疗方法。

可对13种抗生素进行敏感性测试：

阿莫西林(Amoxicillin)

阿莫西林克拉维酸(Amoxicillin + Clavulanic acid)

头孢氨苄(Cephalexin)

强力霉素(Doxycycline)

恩诺沙星(Enrofloxacin)

麻保沙星(Marbofloxacin)

二氟沙星(Difloxacin)

氟甲喹(Fluméquine)

氯林可霉素(Clindamycine)

抗生素微生物检定法

抗生素微生物检定法work Information Technology Company.2020YEAR

抗生素微生物检定法

本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验（标准曲线法除外）。

除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。

管碟法

本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

（一）基本设备、用具、试验材料及标准品

1. 基本设备

（1）抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。

（2）超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。

（3）抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。

2. 用具

（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16~17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。新购的双碟应按上述要求进行检查。检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160 ℃干热灭菌2小时后备用。

（2）陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。

（3）不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

菌种初筛操作方法

菌种初筛是指在菌种发酵前，通过一系列试验和操作，判断菌株的生长状态和发酵能力的过程。以下是一般的菌种初筛操作方法：

1. 菌株培养和接种：选取菌株，将其在含有菌落生长基质的培养基上进行前处理。可以通过涂布接种、点式接种、线条接种等方式进行。

2. 菌种活性检测：通过涂布或点式接种方法将接种后的菌株在适宜温度下培养，并观察菌种的生长情况和活力。

3. 菌株形态观察：观察菌株的生长速度、菌落形态、颜色等形态特征，并与已知菌种进行比较。

4. 革兰氏染色：菌株培养后，进行革兰氏染色，根据细菌细胞的染色特征，判断菌株的细菌形态和细菌类别。

5. 生理生化检测：通过一系列生理生化试验，例如氧需求情况、温度的适应能力、产酸产碱能力等，判断菌株的生长特性和代谢能力。

6. 抗生素敏感性测试：通过传统或自动化方法，测定菌株对不同种类抗生素的敏感性或耐药性，以评估菌株的抗性。

以上是一般的菌种初筛操作方法，根据具体实验目的和需要，还可以根据实际情况进行个别改变或添加其他操作。

实验11-抗生素的抑菌试验

实验十一抗生素的抑菌试验

一目的要求

1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法

2、了解抗生素的抗菌谱

二实验原理

抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。

由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。

三实验器材

1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。

2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。

3、试剂青霉素、链霉素。

四方法步骤

1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。

2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。

3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。

抗生素效价测定操作规程

1.主题内容和适用范圉

本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。本规程

适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。

2.引用标准

《中国药典》2010年版二部。

3.术语

抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。

抗生素微主物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法釆用的是管碟法。

4.操作技术（仪器与用具）

4.1操作室：光线明壳，操作间分&一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25°Co 注意抗

生素的污染。

4. 2双蝶：内径90mm高16-17呗用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液中浸

泡过夜，冲洗，沥干150-160°C干热灭菌2小时或高压灭菌121o C30min,备用。

4. 3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。

4. 4 钢管：内径 6. 0±0. 1mm 高7. 8±0. 1mm 或8. 0±0. 1mm, 10. 0±0. lmm.重量差

异不超±0. 05g.用后置1:1000苯扎澳钱溶液内浸泡2h以上，再灭菌洗涤，先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁，水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160°C

干热灭菌2小时备用.

4. 5钢管放置器

4. 6恒温培养箱：隔水式为宜35-37°C

4. 7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml）,用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯

扎漠鞍溶液中消毒后再常规洗涤.150- 160°C干热灭菌2小时备用.

实验室菌种筛选的一般步骤

实验室菌种筛选的一般步骤如下：

1. 收集样本：从自然环境中收集样品，例如土壤、水体、植物表面等。

2. 分离：将样品进行序列稀释，然后将其分布在富含营养物质的琼脂平板上。孵育一段时间后，单独的菌落开始形成。

3. 纯化：从菌落中选择纯净的菌种，通过划线法或分装法将它们分离到新的琼脂平板上。

4. 生理特性测定：通过一系列实验，如形态学观察、生长速率测定、营养需求测试等，来评估菌种的生理特性。

5. 生化特性测定：通过一系列生化试验，如氧需求、产气、酸碱反应等，来进一步了解菌种的特性。

6. 代谢产物检测：检测菌种产生的代谢产物，如抗生素、酶等。

7. 抗性测试：测试菌种对不同抗生素、重金属或其他有害物质的抵抗力。

8. 毒性测试：评估菌种对人类和环境的毒性。

9. 鉴定：根据以上的实验结果，使用各种技术和方法，如形态学观察、生化分析、蛋白质或基因序列分析等，来确定菌种的

分类学身份。

10. 保存和文献整理：保存纯净的菌种并记载相关信息，并整理实验数据和文献资料，以备将来参考和使用。

实验11-抗生素的抑菌试验

实验十一抗生素的抑菌试验

一目的要求

1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法

2、了解抗生素的抗菌谱

二实验原理

三实验器材

1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。

2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。

3、试剂青霉素、链霉素。

四方法步骤

1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。

2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。

3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。

抗生素的测定

抗生素效价的生物测定

一、目的要求

学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。

二、基本原理

某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。

抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。

本实验以龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的土霉素效价测定为例。

三、器材

黄色八叠球菌（Sarcina flava）；

（土霉素效价测定用）培养基，

（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，

（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；

培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶， 0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。

四、操作步骤

1．pH6．0磷酸缓冲液的配制

实验四__抗生素抗菌谱测定16页PPT

1 倒牛肉膏蛋白胨平板
2 取0.2ml大肠杆菌菌液加入平板中，涂布均匀。
3 将平板(皿底）划分为6等份，每一等份内标明一种抗生素的名称；分别将浸有各种抗生素的小圆滤纸片贴在平板的每一等份中。
4 将贴好滤纸片的含菌平板，置37℃倒置培养24-48h。
5 测量并记录抑菌圈的直径，抑(杀)菌圈的大小，能够反映抗生素抑(杀)菌能力的大小；根据其直径的大小，可初步确定大肠杆菌对各种抗生素的耐药性情况(或敏感性情况)(自带尺子）
实验材料
菌种：
各种不同来源的细菌。
培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基
供试抗生素：
四环素（母液浓度50mg/mL，溶于水)
设备与用具：
恒温培养箱、接种环、培养皿。
实验步骤
1 倒（牛肉膏蛋白胨＋25mg/L四环素）平板
2 将平板(皿底）划分为6等份，每一等份内标明一种细菌的名称；
3 用接种环分别接种不用来源的细菌至相应的区域
2
1
3
⑦
4 6百度文库
5
①氨苄青霉素②卡那霉素③四环素④ 庆大霉素⑤链霉素 ⑥壮观霉素⑦无菌
水
实验结果
抗生素
抑（杀）菌圈直径/mm
抗生素
氨苄青霉素卡那霉素四环素
庆大霉素链霉素壮观霉素
抑（杀）菌圈直径/mm
思考题
1、什么叫抗生素？什么是耐药性？ 2、微生物产生耐药性的原因有哪些？

抗生素残留量检查法标准操作规程

1 目的 (2)

2 范围 (2)

3 职责 (2)

4 依据 (2)

5 定义 (2)

6 内容 (2)

6.1 说明............................................................................................... 错误！未定义书签。

6.2 原理 (2)

6.3 实验材料 (2)

6.4 操作步骤 (3)

6.5 判定标准 (3)

6.6 注意事项 (4)

7 相关文件 (4)

8 附件 (4)

9 变更历史记录 (4)

1目的

1.1本规程规范了抗生素残留量检查法的操作过程。

2范围

2.1本规程适用于供试品中氨苄西林的残留量检查。

3职责

3.1质量检验人员：应严格执行本规程的规定。

3.2质量保证人员：负责对本程序的执行进行监督、检查。

4依据

4.1《中国药典》2010年版三部，附录ⅨA，“抗生素残留量检查法”P59~P60。

5定义

N/A

6内容

6.1原理

6.1.1抗生素残留量检查法是依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品

与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中抗生素的残留量。

6.2实验材料

6.2.1仪器

6.2.1.1生物安全柜

6.2.1.2恒温培养箱

6.2.1.3恒温水浴锅

6.2.1.4游标卡尺

6.2.2器具

6.2.2.1牛津杯规格：内径6mm、外径8mm、高10mm 6.2.2.2玻璃平皿规格：直径约90mm

6.2.2.3试管及硅胶塞规格：18×180mm

6.2.2.4吸管规格：10ml

植物内生菌的筛选及其抗性测定

3.1.1、对种子萌发测定法方法：取 5% NaClO 对待测种子进行表面消毒后，使用灭菌水淋洗 3 次。培养皿中铺灭菌纸，生防菌发酵液的不同倍数稀释液；CK：SNB 对照，设置 3 次重复，每皿培育 30 粒种子，28℃暗培养，在种子露白后的 24h 和 48h 测定各种子胚芽长度。
Page 7
Page 9
3.1.4、根系活力测定：取各青稞根样 0.5g 于试管中，加等量混合液 0.4% TTC 溶液和磷酸缓冲液 10mL，37℃下保温 1h 后加入 2mL 1mol·L-1硫酸以终止反应。将水分吸干，加 4mL 乙酸乙酯和少许石英砂研磨，提取 TTF。加乙酸乙酯定容，分光光度计 485nm 下比色，以空白作空白对照，参比光密度，查找标准曲线，求出四氮唑还原量，并计算出其还原强度。
Page 4
1.2、复筛拮抗菌
具体步骤：对初筛后的优良内生菌，用打孔器打成 4mm 菌饼，将 3 块接种于 150ml 的液体培养基内，28℃， 180r/min 培养 60h，后于冷冻离心机上 8000r/min 离心 20min，上清液既为待测发酵液。将上述处理后的内生菌发酵液 3ml 与 20ml 的培养基充分摇匀混合制平板，待培养基冷却后在平板中央接种直径为 4mm 各植物致病菌菌块，以加灭菌水的 PDA 培养基为对照。试验设 3次重复， 28℃暗培养 3d，观察测量并记录菌落直径。记录结果并计算抑制率。