FCM原理及临床应用(新)

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流式细胞仪原理及操作步骤

流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。

(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCSRPMI1640,DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

流式细胞术在临床医学的应用

流式细胞仪在医学检验中的应用流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。

近年来，FCM的发展日新月异，技术不断有新的突破，新型仪器不断涌现，同时，FCM 在医学及其他科学的应用更加广泛和深入，涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面，涉及免疫学、血液学、肿瘤学等。

图1. 流式细胞术工作原理图一、流式细胞术的研究进展1. 流式细胞仪的进展近年来，随着将多种不同波长的新型激光器与新型荧光染料的新型染色剂相结合，流式细胞仪性能不断提升，体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升，以及激光通道和参数的增多。

此外，流式细胞仪不断打破传统的界限，实现了多学科的交叉发展，诞生了一些新理念、新技术融合的仪器。

例如，微流控芯片流式细胞仪，是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪，具有结构简单、操作方便、体积小、价格低廉等特点；声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦于流动室的中轴上，代替传统的流体动力，实现高通量、高精确度分析；质谱流式细胞仪将传统流式细胞仪与质谱分析技术相结合，采用同位素标记特异性抗体，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重叠、影响分辨的问题；将传统的流式细胞仪的荧光信号与荧光显微镜的形态学结合，形成了成像流式细胞仪，检测者可以目睹到每个细胞或颗粒的形态。

质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪。

2. 流式细胞术的进展FCM主要用于分析荧光标记的细胞和颗粒，也是目前广泛的应用领域。

但是，新近研究打破了这一界限，实现了流式细胞仪由检测荧光标记的细胞，到可以检测无需荧光标记细胞的飞跃，这种技术对细胞无损坏、避免了荧光染料的干扰，将进一步提升FCM的应用范围和价值。

有学者研究出一种新的FCM，称为实时变形性流式细胞术(real-time deformability cytometry，RT-DC)，利用肿瘤细胞等细胞的内在特性——变形能力，对无标记的目标细胞分析，这种无标记的分析方法为流式细胞分析增加了新的可能。

流式细胞计数方法

流式细胞计数方法一、流式细胞计数方法概述流式细胞计数（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速测量、分析和分选的技术。

它基于细胞在一个线性流动通道中通过激光束时，根据激光与细胞产生的散射光信号和荧光信号，对细胞进行定量、定性及分类。

流式细胞计数方法在生物学、医学等领域具有广泛的应用价值。

二、流式细胞计数技术的原理与应用1.细胞标记技术细胞标记技术是将荧光染料或其他示踪剂标记在细胞表面或内部，通过流式细胞仪检测标记物的信号，实现对细胞的特异性识别和定量分析。

常用的细胞标记物有荧光素、藻红蛋白、量子点等。

2.流式细胞仪的构成与工作原理流式细胞仪主要由光源、流动细胞室、光学系统、检测器、数据处理系统和样品制备系统等部分组成。

光源发出的光束经过流动细胞室时，照射到细胞，根据细胞产生的散射光和荧光信号，经过光学系统收集和传递，由检测器转换为电信号，最后通过数据处理系统进行分析。

3.流式细胞计数的应用领域流式细胞计数技术在生物科学、临床医学、免疫学、细胞生物学等领域具有广泛应用。

例如，在免疫学研究中，通过流式细胞计数可以对T细胞、B细胞等进行分选和检测；在细胞生物学研究中，可以用于检测细胞周期、细胞凋亡、细胞表面受体等。

三、流式细胞计数的优缺点优点：1.快速、高通量：可在短时间内对大量细胞进行检测和分析。

2.灵敏度高：对细胞数量较少的情况仍具有较好的检测效果。

3.分辨率高：可以对细胞表面和内部的抗原进行精确检测。

4.多样本分析：可同时检测多种标记物的表达。

缺点：1.样本要求较高：需对细胞进行适当的处理和标记。

2.设备昂贵：流式细胞仪价格较高，维护成本较高。

3.数据处理复杂：需要专业知识和技能进行数据分析和解读。

四、流式细胞计数在生物科学研究中的应用案例1.研究细胞表面抗原的表达：通过流式细胞计数，可以检测细胞表面抗原的表达水平，探讨细胞分化和发育过程中的分子机制。

2.细胞凋亡分析：利用流式细胞计数检测细胞凋亡率，了解细胞在生理和病理条件下的存活状态。

FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用

流式细胞术的概念
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长（nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期：细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠，因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或阴性。
525、625

流式细胞术简介及应用进展课件

流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
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2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。

流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。

概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。

一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。

待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。

2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。

（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。

（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。

（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。

（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。

（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。

（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。

3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。

二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。

FCM技术的临床应用

FCM技术的临床应⽤流式细胞技术的基本原理和临床应⽤浙江⼤学医学院附属第⼀医院传染病研究所徐陈槐流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是利⽤流式细胞仪对细胞等⽣物粒⼦的理、化及⽣物学特性进⾏分析的⽅法。

它集中了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。

利⽤流式细胞仪可以对细胞等⽣物粒⼦的理化及⽣物学特性(细胞⼤⼩、DNA 含量、细胞表⾯抗原表达等)进⾏定量、快速、客观、多参数相关的检测。

流式细胞仪的基本原理是采⽤流体动⼒学聚焦以保证细胞按同⼀⽅式逐⼀通过激光束(检测区)。

当样本流中的细胞经过流动室中的检测区时，椭圆形的激光束即可检测到细胞信号。

包括细胞的散射光以及细胞上标有的荧光染料发出的激光。

⼀、流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的流动室中有⼀长⽅形通道，加压的鞘液从通道底部进⼊流动室向上流动，检测区位于通道的中央。

当鞘液在通道中流动时，样本流被射⼊鞘液中，鞘液包裹着样本，但并不与其混合。

鞘液的压⼒将样本流聚焦，使其在流动室中逐⼀通过激光检测区。

根据激光束检查到的信号不同，将其分为前向散射光、侧向散射光及荧光。

激光束上的低⾓度散射光被称为前向散射光(FS)，主要反映细胞的⼤⼩；与激光束成90度⾓收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要反映细胞的颗粒特性。

如SS可以区分淋巴细胞，单核细胞及粒细胞。

除FS和SS外，细胞亦可发出荧光(FL)。

根据所应⽤的试剂不同，这些荧光可以使仪器得到细胞的⼀些特征，如：FL可以⽤于确认分⼦，像表⾯抗原等。

⼆、光的收集：前向检测器⽤来收集前向散射光，当有散射光到达前向检测器，即会产⽣电压信号。

根据检测器收集到的光信号的不同，电压信号亦不相同。

侧向散射光波长488nm，较荧光强。

它是第⼀个从收集镜/空滤⽚装置中被分离出来的。

应⽤488nm 的⼆向⾊性长通滤⽚(488DL)在45度⾓时，使前向散射光偏转⾄SS检测器，同时⼜使波长较长的荧光通透过去。

fcm算法原理

FCM算法原理详解一、引言文档的主题是关于模糊C均值（Fuzzy C-Means，FCM）算法的原理。

FCM是一种迭代的、非线性的聚类方法，它是模糊集理论在数值分析中的应用之一。

由于其出色的性能和灵活性，FCM已被广泛应用于各种领域的数据分析中，如图像处理、模式识别、机器学习等。

二、基本概念1. 模糊集：模糊集是一种扩展了经典集合论的数学工具，它允许元素部分地属于某个集合。

模糊集的定义包括隶属度函数和模糊集合两个部分。

2. 隶属度函数：隶属度函数是一个定义在论域上的一个实值函数，用于描述一个元素属于模糊集的程度。

3. 模糊聚类：模糊聚类是一种基于模糊集理论的聚类方法，它允许一个数据点同时属于多个类别。

三、FCM算法原理FCM算法的目标是找到一个模糊划分，使得每个数据点的隶属度之和最大。

具体来说，FCM算法的步骤如下：1. 初始化：设定聚类的个数c，以及每个数据点的初始隶属度矩阵U。

2. 计算隶属度：根据当前的隶属度矩阵U和数据点之间的距离，计算每个数据点隶属于每个簇的隶属度。

3. 更新隶属度矩阵：根据计算出的隶属度，更新隶属度矩阵U。

4. 判断是否满足停止条件：通常，当隶属度矩阵U的变化小于一定的阈值时，或者达到预设的最大迭代次数时，算法停止。

5. 返回聚类结果：返回最终的隶属度矩阵U，并根据U的值将数据点分配到不同的簇。

四、FCM算法的特点1. 模糊性：FCM算法允许一个数据点同时属于多个簇，这是传统硬聚类方法无法做到的。

2. 自适应性：FCM算法可以根据数据的分布自动调整聚类的个数，这使得FCM 算法具有很好的自适应性。

3. 全局优化：FCM算法通过最大化隶属度之和来寻找最优的聚类结果，这是一种全局优化的方法。

五、FCM算法的应用由于FCM算法的上述特点，它已被广泛应用于各种领域。

例如，在图像处理中，FCM算法可以用于图像分割和特征提取；在模式识别中，FCM算法可以用于分类和回归；在机器学习中，FCM算法可以用于聚类和降维等。

流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪（Flow Cytometry）之老阳三干创作1 流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry,FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的收集和分析技术等.流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶.流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术.其特点是：丈量速度快、被测群体年夜、可进行多参数丈量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数丈量,且在统计学上有效.1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形出生于1934年,Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置丈量的设想.1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室.其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不竭改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用.近20年来,随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标识表记标帜、软件开发等方面的工作,以扩年夜FCM的应用领域和使用效果.宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术论述的最为详尽和透彻的中文著作.这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,非常适合从事此方面专业研究的人.由于这本书是13年前出书的,所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术.另外对只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说,这本书太复杂太深奥.谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用.杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞仪的应用.本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后,用比力通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必需了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括.2 流式细胞仪的工作原理和技术指标2．1 流式细胞仪工作原理除电源外,流式细胞仪主要由四部份组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件.这四年夜部件共同完成了信号的发生、转换和传输的任务.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,经常使用光学玻璃、石英等透明、稳定的资料制作.设计和制作均很精细,是液流系统的心脏.样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出.为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s.由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上.流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动.激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才华发出荧光供收集检测.经常使用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器.光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定.汞灯是最经常使用的弧光灯,其发射光谱年夜部份集中于300～400nm,很适合需要用紫外光激发的场所.氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强,约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部份,以647nm较强.免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器.将有机染料做为激光器泵浦的一种成分,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器.例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可获得550～650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率最高,约可占到一半.为使细胞获得均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近.因此需将激光光束经透镜会聚.光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD.λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径.色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ.为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片.带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过.例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过.长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射.在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采纳二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开. 光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所发生的荧光是通过光电转换器转酿成电信号而进行丈量的.光电倍增管（PMT）最为经常使用.PMT的响应时间短,仅为ns数量级；光谱响应特性好,在200～900nm的光谱区,光量子产额都比力高.光电倍增管的增益从10到10可连续调节,因此对弱光丈量十分有利.光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太年夜.一般功耗低于0.5W；最年夜阳极电流在几个毫安.另外要注意对光电管进行暗适应处置,并注意良好的磁屏蔽.在使用中还要注意装置位置分歧的PMT,因为光谱响应特性分歧,不宜互换.也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好.从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放年夜后才华输入分析仪器.流式细胞计中一般备有两类放年夜器.一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放年夜器.线性放年夜器适用于在较小范围内变动的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA丈量等.另一类是对数放年夜器,输出信号和输入信号之间成经常使用对数关系.在免疫学丈量中常使用对数放年夜器.因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光丈量中,用对数放年夜器收集数据易于解释.另外还有调节便利、细胞群体分布形状不容易受外界工作条件影响等优点.计算机和分析系统经放年夜后的电信号被送往计算机分析器.多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光信号的强弱相关的.对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目.多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处置器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用.计算机的存贮容量较年夜,可存贮同一细胞的6～8个参数.存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处置和分析,最后给出结果.除上述四个主要部份外,还备有电源及压缩气体等附加装置.2．1．1 信号的发生、转换和传输在压力作用下,鞘液管中的鞘液被继续不竭地压入流动室,形成一股稳定地连续的液流,保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上,并以单个细胞形式直线通过激光照射区.激光照射区又称丈量区,是指液流与激光束垂直相交的点.当细胞携带荧光素标识表记标帜物（每种物质携带的标识表记标帜物分歧吗?）通过激光照射区时,发生代表细胞内部份歧物质、分歧波长的荧光信号,这些信号以细胞为中心,向空间360°立体角发射,发生散射光和荧光信号.散射光不依赖任何细胞样品的制备技术,因此被称为细胞的物理参数或固有参数.散射光又包括前向角散射和测向角散射.前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关,测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息.荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号,另一种是经过特异荧光素标识表记标帜后的细胞受激发照射后获得的荧光信号.在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号,就采纳二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开.经荧光染色的细胞受到适合的光激发后发生的荧光是通过光电转换器转酿成电信号而进行丈量的.最经常使用的光电转换器是光电倍增管（PMT）.从PMT输出的电信号需要经过放年夜后才华输入分析仪器.流式细胞仪中一般备有两类放年夜器.一类是线性放年夜器,其输出信号与输入信号成线性关系.线性放年夜器适用于在较小范围内变动的信号以及代表生物学线性过程的信号,如DNA丈量等.另一类是对数放年夜器,其输出信号和输入信号之间成经常使用对数关系.在免疫学丈量中常使用对数放年夜器.放年夜后的电信号被传送到计算机,再经模一数转换器传输到微机处置器形成数据文件,保管在计算机上.保管在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处置和分析.参数（例如：细胞的年夜小、形态、质膜和细胞内部结构）丈量原理流式细胞仪可同时进行多参数丈量,信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号.丈量是在丈量区进行的,所谓丈量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点.液流中央的单个细胞通过丈量区时,受到激光照射会向立体角为2π（360°）的整个空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长相同.散射光的强度及其空间分布与细胞的年夜小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关.未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,因此可利用分歧的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选.经过固定的和染色处置的细胞由于光学性质的改变,其散射光信号固然分歧于活细胞.散射光不单与作为散射中心的细胞的参数相关,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关.在流式细胞术丈量中,经常使用的是两种散射方向的散射光丈量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC）,又称90角散射.这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间年夜致所成的角度.一般说来,前向角散射光的强度与细胞的年夜小有关,对同种细胞群体随着细胞截面积的增年夜而增年夜；对球形活细胞经实验标明在小立体角范围内基本上和截面积年夜小成线性关系；对形状复杂具有取向性的细胞则可能不同很年夜,尤其需要注意.侧向散射光的丈量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息.侧向散射光虽然也与细胞的形状和年夜小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也能对细胞质内较年夜颗粒给出灵敏反映.在实际使用中,仪器首先要对光散射信号进行丈量.当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞.光散射丈量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群.荧光信号主要包括两部份：①自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光分歧.自发荧光信号为噪声信号,在大都情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和丈量.在免疫细胞化学等丈量中,对结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键.一般说来,细胞成分中能够发生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高,自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强.减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要办法是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采纳电子赔偿电路,将自发荧光的本底贡献予以赔偿.2．1．2 流式细胞仪分选原理其实不是所有的流式细胞仪都具有分选功能.流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的.由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动,断裂形成均匀的小液滴.根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中.使用分歧孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果.从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间.精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,可根据具体要求进行适当调整.2．1．3 数据的显示和分析数据处置主要包括数据的显示和分析.单参数直方图是使用最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析.单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图.横座标X是所测的荧光或散射光的强度,用“道数”（Channel No．）来暗示.选择的放年夜器类型分歧,标度分歧.纵座标Y通常暗示被测细胞的绝对数目.正常情况下,数据分析获得的图形为具有一个或若干个峰的曲线图.对曲线图的解释应该具体问题具体分析.除直方图外,数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等.二维点图也是比力经常使用的数据显示类型.它显示两个自力参数与细胞相对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定,点的位置标明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值.二维点图所提供的信息量要年夜于单参数直方图.数据分析的方法年夜体可分为参数法和非参数法两年夜类.当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法.非参数分析法不用对显示的图像做任何假设,也不采纳数学模型,分析法式可以很简单,也可能很复杂.临床医学较常使用非参数分析法. 2．2 流式细胞仪性能的技术指标流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等.荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离,通经常使用变异系数（CV 值）来暗示.现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%.荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力.一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来暗示.目前仪器均可到达1000左右.仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml.分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目.一般分析速度为5000～10000,分选速度控制在1000以下.流式细胞仪丈量的数据是相对值,因此需要在使用前对系统进行校准或标定.流式细胞仪的校准有二个目的,即仪器的准直调整和定量标度.通常使用标准微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标准样品.3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍目前拥有市场较年夜份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec公司.3．1 BD公司流式细胞仪介绍BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter）,即荧光激活细胞分选器.其型号种类比力齐全,如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean.现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）、FACS CAlibur（流式细胞仪）、FACSA ria（流式细胞分选仪）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪）、LSR II（数字化分析型流式细胞仪）.FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的.FACSCalibur是全自动多色流式系统,偏重于临床,其整体设计帮手临床医生快速实现惯例免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析,兼具分选功能.配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数.可识别粘联细胞.BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,分析速度达50,000/s.使用石英杯流动检测池固定光路校准技术.使用三种激光,多色分析,分析参数可达15色.两管或四管分选,可以使用多种规格的收集管.液流监测系统白动监测液流断点,检查梗塞,实现了细胞分选的无人把持.配件BDACDU装置,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞.FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪.六色荧光分析系统,点对点分选,配置FACS Diva数字化系统,提供全面的配套试剂.速度和功能优于FACSV antage.BD LSR II是LSR的数字化升级版,其性能介于FACSV antage SE 和FACS Calibur之间,是专为生命科学研究设计的台式机.配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比力易学易用.3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍Beckman- Coulter 公司生产的流式细胞仪以Profile（早期,现已停产）和EPICS系列为代表,近年又推出了Cytomics FC500系列.EPICS系列是年夜型流式细胞仪,目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号,其中ALTRA具有分选功能,适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析.Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小,可自动进行5种颜色的分析,适用于免疫学检测,如人类HIV诊断.特别是FC500MPL的共同设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板.特别适合工作量年夜的实验室.这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产,其产物可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等.这二个公司的流式细胞仪价格昂贵,我国主要购买、使用的单元基本上都是一些医疗机构.3．3 Partec公司流式细胞仪介绍与BD和Becman-Coutler公司的产物相比,德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小,造价低,易把持,便于携带,适合植物学研究,适合遥远地域和发展中国家.德国Partec公司的产物分为三类：CCA家族、PAS 家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产物,已停产）.CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I.它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些惯例分析,如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）、细胞计数、细胞凋亡.它的特点是体积小,易把持,价格低,检测范围广,可以检测多种荧光素（如PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光.PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III （PAS-III）和倍性分析仪PA-II.提供三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料.最多可检测和记录八个自力荧光参数.倍性分析仪PA能够在2分钟内自动丈量植物的倍性水平,检测异倍体.可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物资料进行分析.在年夜大都植物中,异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体.PA-I使用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可发生紫外激发光和蓝光.PA-II中增加了488nm氩离子激光器,能够检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等.汞灯发光是电流经过气体时,气体电离发生的.它能提供最佳的激发波长.CyFlow（R）SL配备三种激光管,可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究.如HIV扫描中免疫标识表记标帜细胞计数、食品处置过程中的微生物计数、细胞凋亡等.它使用l2 V直流电,特别适合遥远地域和发展中国家.国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith,1983）,众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法（Michaelson,1991）.应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量（Baird,1994；Jacob,1996；HALL,2000）和倍性水平（Costich,1993；Meng,2002）、检测体细胞杂种（Pfosser,1995；Keller,1996）和游离小胞子培养再生株（Kim,2003）的DNA含量.过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几,且年夜多是在国外实验室完成的.研究内容包括植物生理、法式性死亡、倍性鉴定等.植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产物,也有少量是BD公司生产的流式细胞仪.BD公司的产物主要定位于医学研究与应用,与Partec产物相比,不太适合从事植物染色体倍性的鉴定.主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数目少.鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪,在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细陈说.如何选择流式细胞仪自七十年代呈现第一代流式细胞仪以来,随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不竭发展,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃.流式细胞仪生产厂商推出各种分歧型号的流式细胞仪来满足用户的分歧需要.现生产流式细胞的厂商全球至少有六家,各厂商产物又有分歧的系列,各具特点.如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型,我们还需从分析应用动身,评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己.⑴、DNA倍体分析DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目.由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞分歧,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系.DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛.特别地,它可暗示出细胞毒性药物对细胞作用过程.这些DNA检测还可与细胞概况标识表记标帜物标识表记标帜同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标识表记标帜物的细胞显示其生长周期情况.所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,经常使用的染料为PI,DAPI.流式细胞仪要求：488nm光源,575nm滤光片.⑵、细胞生存能力实验。

fcm测定法

FCM测定法1. 引言FCM（Flow Cytometry）测定法是一种基于流式细胞仪的技术，用于对细胞进行多参数分析和定量测量。

该方法通过检测细胞在流式细胞仪中通过时的光散射和荧光信号来获得关于细胞特性的信息。

在生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域，FCM测定法被广泛应用。

本文将介绍FCM测定法的原理、仪器设备、操作步骤以及应用领域。

2. 原理FCM测定法基于细胞在流式细胞仪中通过时的光散射和荧光信号。

当细胞通过流式细胞仪时，细胞会被单个聚焦的激光束照射，并同时测量细胞的散射光和荧光信号。

根据散射光的特性，可以将细胞分为前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。

FSC与细胞的大小成正比，SSC与细胞的复杂度和颗粒物的数量成正比。

通过测量FSC和SSC，可以初步分析细胞的大小和复杂度。

荧光信号的测量则依赖于细胞的特定标记物。

通过给细胞标记荧光染料，可以测量特定标记物的荧光强度，从而获得关于细胞表面分子、内部结构和功能的信息。

3. 仪器设备3.1 流式细胞仪流式细胞仪是进行FCM测定的关键设备。

它由激光器、光学系统、流体系统和数据分析系统组成。

激光器产生单色或多色激光束，通常使用氩离子激光器、固态激光器或半导体激光器。

光学系统包括透镜、滤光片和光电二极管。

透镜用于聚焦激光束，滤光片用于选择特定波长的荧光信号，光电二极管用于转换光信号为电信号。

流体系统用于将细胞悬浮液输送到流式细胞仪中，并控制细胞通过的速度和流量。

数据分析系统用于采集和分析细胞的光散射和荧光信号。

通常使用计算机软件进行数据处理和结果展示。

3.2 标记物在FCM测定中，常用的标记物包括荧光染料和荧光标记的抗体。

荧光染料可以直接与细胞结构或分子结合，荧光标记的抗体则可以特异性地识别细胞表面的分子。

常用的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、罗丹明（Rhodamine）、FITC （Fluorescein Isothiocyanate）等。

流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展

流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展一、本文概述流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）作为一种先进的细胞分析技术，自其诞生以来，在生物医学领域发挥了重要的作用。

本文旨在全面概述流式细胞仪的发展历史，深入剖析其基本原理，以及探讨其在不同领域的应用进展。

我们将从流式细胞仪的初步概念出发，追溯其技术的演进过程，分析其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用实例，并展望未来的发展趋势。

通过对流式细胞仪的深入研究，我们希望能够为相关领域的研究人员提供有价值的参考，推动流式细胞仪技术的进一步发展。

二、流式细胞仪的发展历史流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速测量和分析细胞特性的高科技仪器。

自其诞生以来，流式细胞仪在生物医学研究领域发挥了重要作用，其发展历史可追溯至20世纪60年代末。

1965年，美国科学家Wallace H. Coulter首次提出了流式细胞仪的基本概念，并设计出了第一台原型机。

这台机器利用了液流原理和荧光检测技术，可以对单个细胞进行快速、定量的分析。

1970年，Coulter Science公司正式推出了世界上第一台商用流式细胞仪，标志着流式细胞技术的诞生。

随着科技的进步，流式细胞仪在随后几十年中经历了不断的改进和创新。

在硬件方面，流式细胞仪的激光源从最初的单一波长发展到多波长，甚至引入了紫外、红外等多种激光，使得可以同时检测多种细胞参数。

在软件方面，数据分析和处理能力得到了显著提升，可以实现对大量数据的快速、准确分析。

流式细胞仪的应用领域也不断拓宽。

从最初的免疫学研究，到现在的肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，流式细胞仪已经成为了不可或缺的研究工具。

随着单细胞测序技术的发展，流式细胞仪与单细胞测序技术的结合，为深入研究细胞异质性和疾病发生机制提供了新的手段。

流式细胞仪的发展历史是一部科技进步的缩影。

从最初的原型机到现在的多功能仪器，流式细胞仪在硬件、软件和应用领域都取得了显著的进步。

流式细胞术最新进展及临床应用

流式细胞术最新进展及临床应用流式细胞术( F l o w cy t o m e t r y, F C M), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检验不可替代的检测方法之一。

传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。

近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。

1定量流式细胞术定量流式细胞术( Q u a n tit a ti ve fl o w cy t o m e t r y, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度 ( M e d i a n fl u o r e s ce n t i n t e n s it y, M F I ) 或每个细胞结合的抗体单位( A n ti b o d i e s b o und t o p e r ce ll,A BC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。

定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于M F I缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化M F I测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。

流式细胞术的工作原理及其临床应用

流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。

本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。

我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。

然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。

我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。

二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。

其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。

待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。

这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。

在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。

这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。

电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。

流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。

这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。

流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。

这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。

流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。

这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。

三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。

流式细胞仪的原理及应用

流式细胞仪的原理与使用一、定义流式细胞仪（flow cytometer）：是集光电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。

流式细胞术（flow cytometry , FCM）：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识及技术。

二、基本结构1.流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管、喷嘴等组成，由透明稳定的材料（化学玻璃、石英等）制成，是液流系统的核心部分。

样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力下从样品管射出。

鞘液由鞘液管由四周流向喷孔，包围在样品外周后由喷嘴射出。

2.激光源和光学系统光源根据被激发物质的激发光谱而定，常用弧光灯和激光。

常用的弧光灯为汞灯，激光器多为氩离子激光器、氪离子激光器或染料激光器。

经过特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发荧光供收集检测。

3.光电管和检测系统荧光染色或荧光标记后的细胞受到合适的光激发后产生的荧光通过光电转换器转变为电信号进行测量。

通常使用光电倍增管（PMT）。

PMT响应时间短，为ns数量级，具有较强光谱响应特性，200～900nm光谱区内光量子产额较高，其增益从103到108可连续调节，有利于弱光的测量。

由PMT输出的电信号放大后输入分析仪器。

流式细胞仪中一般备有两类放大器。

一类为线性放大器，即输出信号辐度与输入信号成线性关系，适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量。

另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。

在免疫学测量中常使用对数放大器。

免疫分析时需要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，其荧光强度相差1～2个数量级；在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。

此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

流式细胞仪原理及应用

BD Biosciences Immune Function
数据存储
• FCS 2.0格式
• 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储
FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720
• 诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）
• 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）
• Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风
湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）
• Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性
淋巴细胞活化功能研究
T淋巴细胞活化
BD Biosciences Immune Function
• 细胞数目增殖 • 细胞表面表达
活化标记 • 分泌细胞因子
CFSE示踪原理
• 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
数据分析
等高图和密度图分析
BD Biosciences Immune Function
数据分析
三维图分析
BD Biosciences Immune Function
BD Biosciences Immune Function

《检验仪器学》FCM原理及临床应用

激发光谱（nm）
488 488 488 488 488 488 488 488 595 635 635 635
发射光谱（nm）
525 565 575 615 667 675 695 767 615 660 667 767
C-Cy7APC-CY7
• 荧光素激发光谱发射光谱 • FITC 异硫氰基 488 525 • R-PE（PE）藻红蛋白 488 575 • ECD 488 615 • PE-Cy5（CyChrome）488 667 • PC7 635 767● ●源自B细胞： CD19+
NK细胞：CD3- CD16+ CD56+
(2) 淋巴细胞亚群细分
●
T细胞（CD3+）：Ts：CD8+CD28Tc：CD8+CD28+ Th：CD4+CD29+ Ti：CD4+CD45RA+
●
B细胞（CD19+）：B1：CD5+CD19+
B2：CD5 -CD19+
根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+、CD8+分为
• 假三维图
在FSC、SSC、FLI、FL2、FL3中任选两个参数为X、Y轴，再以相对细胞数为Z轴，构成三维图，由于Z轴为细胞数，为非测量参数，实际仍是二维图，故称假三维图。假三维图对细胞群体观察更为直观用不同高度的平面切割三维图后，把这些切割图投影到X、 Y平面图上就形成等高图。等高图对细胞的分布趋势优于散点图
机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术为一体的现代细胞分析技术。它是通过流动的细胞悬液测定细胞性质。它以流式细胞仪 (Flow cytometer) 为工具，在单细胞水平上对大量细胞进行高速(每秒计数1000~10000个细胞）、准确、多参数的定量或分选（纯度可达99%以上），已成为现代细胞学研究中最先进的分析技术。

流式细胞仪原理及操作步骤

↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存 5～ 7 天 )
(三 ) 试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液 (见附录 )。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
FCS 50ml ( 终浓度 5 ％ )
4％ NaN ３
50ml ( 终浓度 0.2 ％)
3. 固定液
DPBS
1000ml
葡萄糖
20g ( 终浓度 2 ％ )
甲醛
10ml
NaN ３
0.2g ( 终浓度 0.02 ％ )
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流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪 (FCM) 是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于 FCM 检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 (一 ) 原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二 ) 操作步骤
制备活性高的细胞悬液 (培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法 )
↓ 用 10％ FCS RPMI1640 调整细胞浓度为 5×10 ６～１ ×10 ７／ ml