非那西丁的分子印迹化学发光分析法研究

2005年第63卷化学学报V ol. 63, 2005第3期, 210～214 ACTA CHIMICA SINICA No. 3, 210～214* E-mail: ljr@Received June 4, 2004; revised September 10, 2004; accepted October 18, 2004.No. 3张红鸽等：非那西丁的分子印迹-化学发光分析法研究211MIP 中的识别位点具有和目标分子高度互补的功能基团和空间结构, 因而表现出对目标分子很好的识别性能. 如果将分子印迹技术应用到化学发光分析中, 利用分子印迹聚合物对目标分子选择性识别能力和捕获能力, 使目标分子与样品中的共存物质分离并在分子印迹聚合物上吸附, 然后进行化学发光检测, 那么, 共存物质的干扰就会被消除, 从而能使化学发光分析的选择性大大提高. 根据这一思路, 我们利用鲁米诺-铁氰化钾/亚铁氰化钾化学发光体系成功地建立了测定肾上腺素的分子印迹流动注射化学发光分析法[7].本研究以非那西丁为模板分子, 以甲基丙烯酸为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂, 合成了非那西丁分子印迹聚合物. 选取粒径为74～105 µm 的这种分子印迹聚合物填充在流动注射化学发光分析系统的流通池中, 利用高锰酸钾-甲醛-非那西丁化学发光体系, 建立了高选择性的非那西丁分子印迹-流动注射化学发光分析法, 并对化学发光反应的机理进行了探讨.1 实验部分1.1 仪器与试剂IFFM-D 型流动注射化学发光仪(西安瑞迈电子科技有限公司), 流路如图1所示. 蠕动泵以1.5 mL/min 的速度输送所有溶液; PTFE 管(内径为0.8 mm)连接流动系统中各种部件. 自制的MIP 柱置于CR-105型光电倍增管(PMT, 北京滨松公司生产)的光窗前. KQ-300DE 型医用数控超声波清洗器(昆山市超生仪器有限公司)和超级恒温器(上海实验仪器厂)用于MIP 的合成.图1 分子印迹-化学发光分析流路图P —蠕动泵; D —检测器; F —MIP 柱; PC —计算机; W —废液; S —切换阀. a —高锰酸钾溶液; b —硫酸; c —甲醛溶液; d —样品或标准溶液; e —水Figure 1 Schematic diagram of molecularly imprinted- chemiluminescence methodP—peristaltic pump; D —detector; F —MIP column; PC —computer; W —waste; S—switch valve. a —potassium permanganate; b —sulfuric acid; c —formaldehyde; d —standard solution or sample solution; e —double water非那西丁(中国生物制品鉴定所), 乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA, 分析纯, Sigma 公司), 甲基丙烯酸(MAA, 分析纯, 上海试剂一厂), 偶氮二异丁腈(AIBN, 化学纯, 上海试剂厂, 使用前重结晶), MAA 和EGDMA使用前重蒸馏除去阻聚剂.非那西丁标准储备溶液(1.00×10－4 g/mL): 称取10.0 mg 非那西丁, 用水溶解后, 定容于100 mL 容量瓶中. 非那西丁标准工作溶液由非那西丁储备液稀释之.高锰酸钾溶液(5.0×10－3 mol/L): 称取0.198 g 高锰酸钾, 加水搅拌使其溶解, 定容于250 mL 容量瓶中. 甲醛用二次水新配制, 其它所用试剂均为分析纯, 水为二次去离子水.1.2 非那西丁分子印迹聚合物的制备参照文献[8], 称取0.179 g (1 mmol)的非那西丁, 溶于10 mL 氯仿中, 再加入0.34 mL (4 mmol)功能单体MAA, 用超声波脱气震荡6 h 后,依次加入3.76 mL EGDMA (20 mmol)和52.5 mg AIBN, 转入50 mL 安培瓶中充分混和均匀, 通氮脱氧15 min, 真空状态下密封, 置于60 o C 恒温水浴中加热聚合24 h, 得到块状聚合物. 研磨过筛收集74～105 µm 之间的聚合物粉末. 1.3 非那西丁MIP 柱的制作向一根Y 型玻璃柱的直管 (4 mm i.d.×20 mm)内填充10 mg MIP, 两端用玻璃棉堵住, 制成非那西丁MIP 柱. 将此MIP 柱连接在流路中, 置于光电倍增管的光窗前. 新MIP 柱中模板分子非那西丁尚未除去, 使用前, 使高锰酸钾和甲醛溶液合并流流过MIP 柱, 与柱中的非那西丁发生反应, 产生发光信号. 随着试剂流持续地流过, MIP 中非那西丁不断被消耗, 信号逐渐降低. 当信号降至与背景信号相同时, 表明MIP 柱中非那西丁已经完全反应. 用二次蒸馏水洗净MIP 柱, 备用. 1.4 分析步骤按照图1所示的流路对非那西丁进行测定, 其过程分为四个步骤:步骤1: 吸附非那西丁. 在这一步, 泵1 停止, 切换阀处于d 位置, 泵2 传送非那西丁溶液流过MIP 柱60 s,溶液中的非那西丁被选择吸附在MIP 的空穴中.步骤2: 洗涤除去其它杂质. 在这一步, 泵1停止, 切换阀处于c 位置, 泵2输送甲醛溶液流过MIP 柱70 s, 冲洗掉MIP 柱上除非那西丁以外的其它物质, 并对MIP 柱进行保护.步骤3: 化学发光检测. 在这一步, 切换阀处在c 位置, 启动泵1, 泵2, 高锰酸钾和甲醛溶液合并流流过MIP 柱40 s, 与吸附在MIP 上的非那西丁发生反应, 产生化学发光(CL).步骤4: 清洗MIP 柱. 在这一步, 泵1停止, 切换阀处在e 位置, 泵2输送二次水流过MIP 柱80 s, 洗去MIP 柱上的残留物, 以备下一次检测.212化学学报V ol. 63, 20052 结果与讨论2.1 MIP柱的形状、尺寸和稳定性在测定过程中, 需将高锰酸钾与甲醛混合后流过MIP柱, 与柱上的非那西丁发生化学发光反应. 可能是由于高锰酸钾与甲醛发生反应而彼此消耗, 所以, 如果二者混合时间过长时, 合并流流过MIP柱所产生的信号很低. 应该尽量缩短进入MIP柱前高锰酸钾与甲醛的混合时间, 以提高测定的灵敏度. 为此, 我们设计并采用了一种Y型的玻璃柱, 将10 mg非那西丁MIP填充在Y 型柱的直管内(4 mm i.d.×20 mm)连在流动化学发光系统中. 这样甲醛与高锰酸钾混合后能很快通过填充在直管内的MIP, 与吸附在柱上的非那西丁反应, 产生较强的化学发光信号. 制成的MIP比较稳定, 使用100次后, 其性能无明显变化.2.2 保护剂酸性高锰酸钾是一种强氧化剂, 当其流过MIP柱时, 会氧化MIP中的不饱和键, 而破坏MIP中识别位点的结构, 导致MIP对目标分子的识别能力降低甚至消失. 因此, 必须选择一种还原性的物质对MIP进行保护, 以保证MIP中的识别位点不受破坏. 分别考察了亚硫酸钠、硫代硫酸钠和甲醛对MIP的保护作用. 试验结果表明, 在相同的实验条件下, 甲醛的保护效果最好. 恰巧, 甲醛又是高锰酸钾-非那西丁化学发光反应的增敏剂, 因而甲醛在这里兼有增敏剂和保护剂的双重作用. 考察了甲醛在0.5%～5%浓度(质量分数)范围内对MIP的保护作用和对高锰酸钾-非那西丁反应的增敏作用. 结果表明, 2%是甲醛最合适的浓度. 使用此浓度时, MIP识别性能良好且基本稳定, 而且反应有较大的发光强度.2.3 分析条件的优化按图1所示流路进行.2.3.1 吸附时间选择吸附时间是指非那西丁标准溶液或样品溶液流过MIP柱的时间. 吸附时间决定着非那西丁吸附在MIP柱上的量, 既影响测定的灵敏度, 又影响测定的线性范围. 合适的吸附时间应与非那西丁溶液的浓度、MIP的结合能力以及流速等因素有关. 固定MIP的量为10 mg, 流速固定为1.5 mL/min时, 考察了在10～120 s范围内吸附时间对CL强度的影响. 用浓度为5.0×10－6 g/mL非那西丁标准溶液绘制了吸附时间和化学发光强度的关系曲线, 如图2所示. 由图2可以看出, 对于5.0×10－6 g/mL的非那西丁溶液, CL 强度随着吸附时间的增加而增大, 在90 s时, 吸附基本达到了平衡. 综合考虑方法的线性范围和分析效率, 选择吸附时间为60 s.图2 吸附曲线流速: 1.5 mL/min; 非那西丁溶液浓度: 5.0×10－6 g/mLFigure 2 Adsorption curveFlow speed: 1.5 mL/min; concentration of phenacetin: 5.0×10－6 g/mL2.3.2 洗涤时间在吸附步骤之后, 应该洗涤MIP柱, 以除去滞留在MIP柱中的试液以及柱上非特异性吸附的其它物质. 合适的洗涤时间应是能洗净吸附了非那西丁的MIP柱而又不会使柱上吸附的非那西丁流失. 为了选择洗涤时间, 我们将与非那西丁结构相近, 且在相同条件下能与高锰酸钾发生化学发光反应的氨基比林加入非那西丁标准溶液中作为干扰指示物(非那西丁浓度 5.0×10－6 g/mL, 氨基比林 2.5×10－5 g/mL), 以此溶液进行试验. 在60～180 s范围内, 考察了洗涤时间对化学发光强度的影响. 结果表明, 洗涤时间为70 s时, 即可洗净柱中的氨基比林, 此时测得的化学发光强度与使用不含氨基比林的5.0×10－6 g/mL非那西丁标准溶液时得到的化学发光强度相同. 因此, 选择洗涤时间为70 s.2.3.3 化学发光反应时间化学发光试剂流进流通池时, 化学发光试剂就与吸附在柱上的非那西丁发生反应, 当发光信号回到基线时, 说明柱上的非那西丁已完全反应. 实验表明, 完成这一过程需要40 s.2.3.4 清洗时间清洗流通池中反应残余物质是必要的. 高锰酸钾与非那西丁的反应是氧化还原反应, 反应中, 非那西丁分子被破坏, 而从MIP上脱附. 因此, 让水流过MIP柱即可将反应产物洗去, 留下空穴供下一次测定用. 通过用洗过的MIP柱做空白试验的方法考察了在20～120 s范围内不同清洗时间的清洗效果. 结果表明, 清洗时间大于80 s后, 各空白信号大小无显著性差异, 即80 s已可将反应残留物质清洗干净. 此时再进行化学发光测定, 可得重复性很好的测定结果. 因此, 选择清洗时间为80 s.No. 3张红鸽等：非那西丁的分子印迹-化学发光分析法研究2132.4 化学发光反应条件的优化按图1所示程序对化学发光反应条件进行了优化. 分别考察了高锰酸钾浓度在 5.0×10－5～5.0×10－4 mol/L 范围内, 甲醛的浓度在0.5%～5%范围内, 硫酸的浓度在0.1～5 mol/L 范围内其浓度对CL 强度的影响. 以最大化学发光强度为指标, 选择的最佳条件为: 1× 10－4 mol/L 的高锰酸钾, 2 mol/L 的硫酸, 2%的甲醛. 2.5 校准曲线、精密度和检出限在选择的最佳条件下, 化学发光强度与非那西丁浓度在5.0×10－7～5.0×10－5 g/mL 范围内具有良好的线性关系, 线性回归方程为I ＝10.1C ＋53.4 (r ＝0.9900). 式中 I 是CL 强度(相对单位), C 代表非那西丁的浓度(×10－7g/mL). 对1.0×10－6g/mL 的非那西丁溶液进行11次平行测定, 相对标准偏差为3%, 根据IUPAC 的建议, 测得方法的检出限为2×10－7g/mL. 如果需要, 可以通过增加吸附时间对非那西丁进行富集, 以进一步提高方法的灵敏度. 2.6 选择性试验考察了复方去痛片及尿液中共存物质对所建立方法的干扰情况. 用5.0×10－6 g/mL 的非那西丁溶液进行试验, 在保持相对误差小于±5%的情况下, 试验结果见表1. 由表1可以看出, 使用MIP 与未用MIP 相比, 方法的选择性得到了较大的提高.表1 干扰试验结果Table 1 The tolerable ratio of interfering species to phenacetin with and without MIP物质 使用MIP 时的 干扰倍数未使用MIP 时的干扰倍数氨基比林 50 1 对已酰氨基酚 100 1 苯巴比妥 500 5 咖啡因 200 5 可溶性淀粉 1000 500 葡萄糖 1000 500 果糖 500 100 甘氨酸 200 10 柠檬酸500 2002.7 样品分析2.7.1 去痛片中非那西丁的测定取三种不同牌号的去痛片各10片(根据药典[9]: 每片含氨基比林为0.1395～0.1605 g; 含非那西丁0.1395～0.1605 g; 含咖啡因0.0450～0.0550 g; 含苯巴比妥0.0135～0.0165 g), 准确称重, 求得平均片重. 分别研细后, 各准确称取50 mg, 溶于100 mL 沸水中, 搅拌使非那西丁充分溶解后, 用干燥滤纸迅速滤去杂质, 用滤液作样品溶液. 将样品溶液稀释1个数量级, 按图1所示流路进行CL 检测. 平行测定三份, 测定结果列于表 2. 对本方法的测定结果与药典方法[8]测定结果进行t 检验, 结果表明, 在95%的置信水平上两种方法测定结果无显著性差异.表2 去痛片中非那西丁含量的测定结果Table 2 Determination of phenacetin in amidopyrini et parace tamdi compositae samples using the combination of molecular imprinting and chemiluminescence 样品标识量 本方法 RSD/% (n ＝3) 药典方法1#150 mg/片159 mg/片 2.6 160 mg/片2#150 mg/片155 mg/片 3.4 153 mg/片3#150 mg/片149 mg/片2.1147 mg/片2.7.2 尿液中非那西丁的测定从三名志愿者处取得尿样各10 mL, 分别加入一定量的非那西丁标准溶液, 在离心机上以3000 r/min 的速度离心30 min, 将上层清液转移到100 mL 容量瓶中, 加水定容. 测定时, 加水适当稀释, 用作样品溶液, 按设定的测定程序进行回收试验, 测定结果列于表 3. 对回收率进行t 检验, 结果表明, 置信水平在95%时, 得到的回收率与100%无显著性差异．表3 尿液中非那西丁的测定Table 3 Results of recovery tests on human urine samples Sample Added/(µmol•L －1)Found/(µmol•L －1) Recovery/%1 0 01.000.96 96 2.00 2.04 102 4.00 3.90 97.5 2 0 04.00 3.98 99.5 6.00 6.21 103.5 8.007.79 97.3 3 0 06.00 5.87 97.88.00 8.15 101.8 10.0 10.4 1043 化学发光反应机理的探讨本文利用改装的RF-540荧光分光光度计绘制了高锰酸钾-甲醛-非那西丁化学发光体系的化学发光光谱, 其最大发射波长为630 nm (图3). 在反应物中, 只有非那214化 学 学 报 V ol. 63, 2005西丁是荧光物质, 其最大发射波长为370 nm, 其它各反应物均非荧光物质, 反应产物也没有荧光性质. 由此可见, 此化学发光反应的发光体既不是反应物, 也不是反应生成物, 而只能是反应的中间产物. 据报导, 单线态氧二分子复合物1O 21O 2(1∆g 1∆g )在转化为三线态氧3O 2(3∑g )时化学发光的最大发射波长的理论值为643nm [10]; 发光体为单线态氧分子复合物的ClO －-H 2O 2- OH －体系的最大发射波长是635 nm [10]. 因此, 可以认为高锰酸钾-甲醛-非那西丁化学发光反应的发光体可能是单线态氧分子的复合物. 甲醛则可能通过某种途径促进了单线态氧的形成.基于以上讨论, 本文推测, 此化学发光反应的机理可能如下:MnO 4－＋非那西丁＋甲醛＋H ＋→1O 2(1∆g )＋H 2O ＋Mn(II ～IV)＋产物21O 2(1∆g )→1O 21O 2(1∆g 1∆g )1O 21O 2(1∆g 1∆g )→23O 2(3∑g )＋h ν (λmax ＝630 nm)图3 高锰酸钾-甲醛-非那西丁体系的化学发光光谱 Figure 3 Chemiluminescence spectrum of KMnO 4-formal-dehyde-phenacetin system4 结论本研究发现了高锰酸钾-甲醛-非那西丁化学发光体系, 合成了对非那西丁具有高度选择性的分子印迹聚合物. 以此分子印迹聚合物为非那西丁的分子识别物质, 建立了测定复杂样品中非那西丁含量的分子印迹-化学发光分析法. 这项研究工作表明, 将分子印迹技术用于化学发光分析这一简单操作就能极大地改善化学发光分析法的选择性, 从而解决了化学发光分析选择性差的固有缺点, 使其可用于复杂样品的直接分析. 同时, 这项工作也初步建立了分子印迹-化学发光分析法的基本规范.References1 Nicholls, A. W.; Lindon, J. C.; Farrant, D. R.; Shockcor, J.P.; Wilson, I. D.; Nicholson, J. K. J . Pharm . Biomed . Anal . 1999, 20, 865.2 Nagaraja, P.; Srinivasa Murthy, K. C.; Rangappa, K. S. J .Pharm . Biomed . Anal . 1998, 17, 501.3 Liu, X. Z.; Liu, S. S.; Wu, J. F.; Fang, Z. L. Anal . Chim .Acta 1999, 392, 273.4 Fang, H.-Z.; Lei, L.-L.; Liu, X.-B. J . Pharm. Prac . 1999,17, 31 (in Chinese).(方洪壮, 雷力力, 刘兴宝, 药学实践杂志, 1999, 17, 31.) 5 Wei, Y.-F.; Yan, H.-T.; Li, X.-H.; Wang, D.-Y. Chin. J .Anal . Chem . 2000, 28, 1451 (in Chinese).(魏永锋, 阎宏涛, 李晓花, 王道永, 分析化学, 2000, 28, 1451.)6 Wu, Y.-Y.; Zhang, S.-C.; Zhao, R.; Li, H. Chin J . Anal .Chem. 2000, 28, 318 (in Chinese).(武亚艳, 张四纯, 赵瑞, 李华, 分析化学, 2000, 28, 318.) 7 Du, J. X.; Shen, L. H.; Lu, J. R. Anal . Chim . Acta 2003,489, 183.8 Tan, Y. G.; Peng, H.; Liang, C. D.; Yao, S. Z. Sens. Actua-tors, B 2001, 73, 179.9 Editorial Pharmacopoeia Commission of People’s Republicof China, Pharmacopoeia of People’s Republic of China (Part II ), Chemical Industry Press, Beijing, 1977, p. 75 (in Chinese).(中华人民共和国卫生部药典委员会, 中华人民共和国药典(二部, 1977年版), 化学工业出版社, 北京, 1977, p. 75).10 Khan, A. V .; Kasha, M. J . Chem . Phys . 1963, 39, 2105.(A0406302 PAN, B. F.; LING , J.)II Graphical Abstract V ol. 63, 2005Theoretical Study on the Reaction of HO2 Radical with NO2 by Density Functional Theory MethodBAI, Hong-Tao; HUANG, Xu-Ri*; WEI, Zhi-Gang; LI, Ji-Lai; SUN, Jia-ZhongActa Chimica Sinica 2005, 63(3), 196 The possible reaction pathways of HO2 radical with NO2 moleculeStudy on the Photo-catalytic Decomposi-tion of Methanol Vapor on Pt-loaded Nano-TiO2 ParticlesCUI, Wen-Quan; FENG, Liang-Rong; XU, Cheng-Hua; LÜ, Shao-Jie; QIU, Fa-Li*Acta Chimica Sinica 2005, 63(3), 203Different nano-sized Pt/TiO2asphotocatalysts was prepared. Thedispersity of Pt on the surface ofTiO2 was measured by hydrogen andoxygen pulse titration.Thephoto-catalytic decomposition ofgaseous methanol on Pt/TiO2 wascarried out in a continuous-flowreactor. The effect of varied factorson the photo-catalysis process wasinvestigated, such as the amount of Pt, different reduction method, the different nano-size, space velocity, illuminating time, adding water vapor and methanol concentration, and also the photo-catalytic activitiesof TiO2 film was compared with those of TiO2 nano-particles.Molecular Imprinting-Chemiluminescence Determination of PhenacetinZHANG, Hong-Ge; LÜ, Jiu-Ru*; HE, Yun- Hua; DU, Jian-XiuActa Chimica Sinica 2005, 63(3), 210A molecular imprinting-chemilumi-nescence method for the determinationof phenacetin was established by usingphenacetin-imprinted polymer asrecognition material and KMnO4-phenacetin-formaldehyde reaction asdetection system. The method hasbeen applied to the determination ofphenacetin in amidopyrini et parace-tamdi compositae and in urinesamples, the results were in goodagreement with those obtained by pharmacopoeia method and the recovery results weresatisfactory.Photoelectrochemical Study on theNanostructured TiO2/PMT Film Electrode HAO, Yan-Zhong*;WU, Wen-JunActa Chimica Sinica 2005, 63(3), 215The photon-current conversionproperties and energy level ofnanostructured TiO2/poly-(3-me-thythiophene) (PMT) film elec-trode were studied by using thephotoelectrochemical methods. Thebandgap of PMT film is 1.93 eV.The conduction band of PMT filmis －3.44 eV. The p-n heterojunc-tion existed in the TiO2/PMT film electrode, which favors the separation of electron-hole pairs. The nanostructure can enlarge the visible optical absorption region and obviously increase the photocurrent in visible region. The photocurrent threshold shifted to ＞600 nm, and the photon-electron conversion efficiency could be improved .。