膜蛋白提取方法

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提取膜蛋白的方法

提取膜蛋白是一项关键的实验步骤，用于研究膜蛋白的结构和功能。本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。

1. 浸泡法

浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液或生理盐水中，并加入一些溶解剂（如阴离子洗涤剂）以破坏膜结构。浸泡一段时间后，离心以分离出溶液中的膜蛋白。

2. 磷脂双层溶液法

磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。首先，将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。磷脂双层膜与细胞膜相似，可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。然后，用洗涤液洗涤磷脂双层，使膜蛋白释放到洗涤液中。

3. 超声法

超声法是一种物理方法，通过超声波的能量来提取膜蛋白。将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中，并使用超声波处理。超声波的能量可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到缓冲液中。然后，对溶液进行离心，将膜蛋白分离出来。

4. 酸碱提取法

酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。首先，将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中，并搅拌。酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构，使膜蛋白溶解到溶

液中。然后，通过调整pH值，使膜蛋白沉淀，进一步提纯。

5. 亲水基质法

亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。细胞或组织样品与亲水基质接触，亲水基质与细胞膜的亲水区域结合，使膜蛋白释放到溶液中。然后，通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。

这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛，但根据具体的实验目的和样品特性，可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度，并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。此外，需要根据实验目的选择合适的检测方法，如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。

细胞膜蛋白的提取

1. 引言

细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。细胞膜蛋白具有多种功能，包括细胞识别、信号转导、运输和通道形成等。为了研究细胞膜蛋白的结构和功能，科学家需要从细胞中提取这些蛋白质。本文将介绍细胞膜蛋白的提取方法和步骤。

2. 细胞膜蛋白的提取方法

2.1 细胞膜蛋白的提取原理

细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质，与细胞膜紧密结合。因此，提取细胞膜蛋白需要破坏细胞膜，并保持蛋白质的完整性。常用的细胞膜蛋白提取方法包括机械破碎法、化学溶解法和超声波法等。

2.2 机械破碎法

机械破碎法是一种常用的细胞膜蛋白提取方法。其步骤如下：

1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。

2.破碎细胞：将细胞悬浮液置于低温条件下，加入适量的缓冲液，然后用高速

搅拌器或超声波破碎仪破碎细胞，使细胞膜破裂。

3.离心：将破碎后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。

4.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。

2.3 化学溶解法

化学溶解法是另一种常用的细胞膜蛋白提取方法。其步骤如下：

1.制备细胞悬浮液：将培养的细胞收集，并用缓冲液洗涤，得到细胞悬浮液。

2.加入溶解剂：向细胞悬浮液中加入适量的溶解剂，如磷酸盐缓冲液或甘油，

使细胞膜破裂。

3.搅拌：将细胞悬浮液与溶解剂充分混合，并用搅拌器搅拌一定时间，使细胞

膜蛋白溶解在溶液中。

4.离心：将溶解后的细胞悬浮液进行离心，分离出上清液和沉淀。

5.收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，这个上清液中含有细胞膜蛋白。

western膜蛋白的提取

分离膜蛋白的方法有两种：1先分离膜，然后提取；2用特殊的去污剂选择性的分离。第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。

方案

1）放射性标记受试细胞

2）将标记的细胞放在冰上

3）去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

4）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min

5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心

6）溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min

7)收集水相留作分析

8）用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心

9）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

10）用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂

2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)

3)buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

这是我在nwfsc上求助膜蛋白提取时别人发给我的email，其实膜蛋白的提取的方法依据膜蛋白的不同类型方法也不一样。是组织还是细胞，细胞膜膜结合蛋白还是细胞器结构膜蛋白，如果是细胞的话建议你买个膜蛋白抽提试剂盒吧。

红细胞膜蛋白提取流程

（1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟
RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟×2
洗净之RBC （2）溶血液制备
RBC加入低渗磷酸buffer（>1:50) (在烧杯中）稍搅拌
置冰箱冻格（4˚C）溶血过夜
溶血液，用“水泵”吸去上清。！！：膜很轻
(上）阴极端滤纸-凝胶-膜-滤纸阳极端（下）
用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。开启电源，调电压时间20 v， 20分钟
2.封闭
将膜取出TBST中洗5’，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗5’×3；
3.一抗孵育
将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
4.二抗孵育
计算：
在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算提取膜的 Pr mg数/ml样品
注意稀释倍数
要求：计算原提取RBC液的Pr含量
五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量
不连续电泳系统：电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）
（一）垂直板安装
每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！
10％分离胶 5％浓缩胶
将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟×3；
5.DAB显色
配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟内）；（试剂盒：蒸馏水1ml ，A、B、C各一滴放入水中）

生物素标记提取膜蛋白以及WB具体步骤

一，Lipo2000转染

1,准备细胞：转染前一天，向含9mlDMEM（含血清不含抗生素）的9cm平板接入细胞，使其在转染时长到90%。转染前用DMEM（―）洗2遍后，加入9mlDMEM（不含血清不含抗

生素） 2,准备混合物：①将6ug质粒稀释于300ulDMEM（―）中，涡旋1s，静置5min。②将18ul Lipo2000稀释于300ulDMEM（―）中，涡旋1s，静置5min。③将①②混匀，

静置20min。

3，将混合物加入平板，前后摇匀。

4,6h后给细胞换DMEM（含血清不含抗生素）。 5，继续培养8―48h，观察。二，生物素标记

1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一

些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。

3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会

有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。 4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。 5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。

6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。 7，向

1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml） 8，4℃涡旋1h。

膜蛋白提取

1分离组织膜蛋白的方法：

1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。

取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

我们实验室提取膜蛋白的方法如下：

1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。3．按 2.5毫升（T75）/每瓶或5毫升（T175/ 每瓶加入冰冷的匀浆液（HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM）于离心管中，将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。

提取蛋白质的4种方法

1. 离子交换：离子交换是最常用的蛋白质提取方法，它使用含有

有机硫酸盐的磷酸盐溶液来提取pH4-9之间的膜蛋白。它使用有机硫

酸盐作为极性试剂，使蛋白质从其离子溶液中沉淀出来并固定到树脂上，从而被提取。

2. 垂直层析：垂直层析是蛋白质提取的另一种方法，它使用流动

相来垂直运动横穿膜，从而把低浓度的蛋白质从其结晶盐溶液中提取

出来。它是一种有效的后处理方法，能有效地改善提取的蛋白质的细节、稳定性和纯度。

3. 高通量流精密：高通量流精密设备可以将流体和分散体相分离，包括沉淀物和蛋白质。它使用高压水流将杂质和悬浮物从蛋白质溶液

中清除，然后用不同的层析方法将蛋白质从其分散体中提取出来。

4. 柱单柱层析：柱单柱层析是另一种蛋白质提取技术，它使用多

种不同的树脂来分离蛋白质从其离子溶液中。它将溶液通过固定式柱，并使用柱中所含的不同类型的树脂来把具有不同电荷性质的蛋白质从

溶液中提取出来。

膜蛋白纯化解决方案

膜蛋白是一种位于细胞膜上的蛋白，主要分为外周膜蛋白和跨膜蛋白两大类。膜蛋白具有重要的生物功能，如控制能量转换、参与信号转导、控制物质运输、维持细胞和组织结构等，因此膜蛋白一直是研究热门，是当前近70%的药物靶标。

想要研究更具体膜蛋白结构或者功能特性，我们首先要提取纯化相应的膜蛋白。接下来以一篇经典Nature文章为例，解析如何提取纯化膜蛋白。

2019年Nature文章：人的T cell receptor–CD3 复合体结构研究

纯化思路：

（1）重组蛋白的构建：

以哺乳细胞HEK293F为表达宿主，在C末端依次加了Strep和His标签。

目的基因：TCRα，TCRβ（pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ（pcDNA3,4）。

（2）重组蛋白的诱导表达：

在37℃、含有5%CO2条件下，120 rpm 培养60 h。

（3）细胞膜结构的制备和溶解：

通过离心收集细胞，然后匀浆破碎。

细胞膜结构组份的收集：用25 mM HEPES，pH 7.5,1 M NaCl缓冲溶液重悬，加入1mM PMSF，100,000g超速离心30 min收集细胞膜结构组份。

细胞膜结构的溶解：用25 mM HEPES，pH 7.5,150 mMNaCl，1% DDM，0.2% cholesteryl hemisuccinate tris salt, 1 mM PMSF, 4℃条件下溶解2 h。

40,000g 离心30 min，收集上清，即为可溶的膜蛋白粗溶液。

（4）亲和层析纯化：

本文作者用StrepTactin 填料进行纯化。

膜蛋白的提取方法

膜蛋白的提取方法通常包括以下几个步骤：

1. 细胞裂解：将包含膜蛋白的细胞或组织用不同的方式进行裂解，例如超声波处理、酸碱处理、高压处理等。

2. 膜蛋白分离：通过离心、过滤等方法将膜蛋白分离出来。

3. 纯化：采用膜层联萃取、柱层析、电泳等方法对膜蛋白进行纯化。

4. 确认：通过蛋白质定量、SDS-PAGE、Western blot等方法验证膜蛋白的存在和纯度。

常见的膜蛋白提取方法有：

1. 酸性洗涤法：利用低pH值时，膜蛋白和膜脂亲性增强的特性，将细胞裂解物在酸性条件下洗涤获得膜蛋白。

2. 有机溶剂提取法：利用膜蛋白亲性较强的有机溶剂，如丙酮、甲醇等，将膜蛋白从细胞裂解物中提取出来。

3. 离心法：通过离心分离膜细胞，从而获得膜蛋白。

4. 免疫亲和层析法：利用特异性抗体将目标膜蛋白从混合蛋白中分离纯化。

以上方法的选择需根据具体情况来定，不同的细胞类型或膜蛋白性质有着不同的最佳提取方法。

膜蛋白提取方法(双向电泳)

膜蛋白提取试剂盒（双向电泳用）

产品组成：

产品组成 BB-3188-1 BB-3188-2

规格 50T 100T

试剂A 10ml 20ml

试剂B 20ml 40ml

试剂C 10ml 20ml

蛋白酶抑制剂混合物 250μl 500μl

储存条件：

蛋白酶抑制剂-20℃保存；

蛋白提取液A和B 2-8℃保存；

试剂C室温保存。

有效期：

一年。

产品简介：

哺乳动物跨膜蛋白承担各种生物功能，在疾病的发生、发展过程中扮演重要角色。膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析及质谱分析等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构，因而妨碍了膜蛋白的功能研究。贝博双向电泳膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂，适用于从细胞和动物组织提取双向电泳用膜蛋白样品。提取过程简单方便，可在1小时内完成。提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。提取的蛋白可直接用于双向电泳蛋白研究。

使用方法：

A．细胞蛋白提取

1.取5-10×106个以上细胞①，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养

基，尽可能吸干，收集细胞。

2.用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3.细胞样品中加入200μl冷的试剂A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡

15秒，置冰上10-15分钟。

4.再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，13000×g条件下离心5分钟。

5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，37℃水浴5-10分钟，37℃下②1000g

膜蛋白提取步骤

膜蛋白提取试剂盒

Membrane Protein Extraction Kit

产品编号：C500049 包装规格：50 Assays 产品简介

本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。特殊的提取Buffer 在裂解细胞的同时，经过特殊处理，还可以选择性地分离提取细胞膜蛋白和胞器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的膜蛋白纯度高，可用于SDS-PAGE 、Western Blot 、免疫共沉淀或细胞信号传导等后续研究，每次可以提取107

个培养细胞或200 mg 动物组织，本试剂盒可以使用50次。

产品特点

1. 整个操作过程只需要60 min 左右。

2. 即可以用于培养细胞（50x107

个），有可以用于动物组织（50 x 200 mg ）蛋白质的提取。 3. 避免蛋白酶对蛋白质的降解，保持膜蛋白质的完整性和天然活性。

提取的膜蛋白纯度高，不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。

运输和保存条件

在常温下运输，收到后，将蛋白酶抑制剂、Loading Buffer 、DTT 于在-20°C 的环境中保存，其余4°C 保存，保质期一年。

产品组成

成分 C500049 洗涤液 10×50 mL 提取Buffer 50 mL 蛋白酶抑制剂 50 μL Loading Buffer 1 mL

DTT

50 μL

操作步骤 1. 对于悬浮培养或用细胞刮子刮下的贴壁培养的细胞，离心收集不少于1×107

细胞，再用预冷的双蒸水稀释的一倍浓度的

洗涤液洗涤细胞三次，每次3000 rpm （800 g ）离心5 min 。

膜蛋白的提取与分离

膜蛋白的分离

一、简介：

1细胞质膜资料

1895年,0verton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成

"。

1925年Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson: 用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子

结构与超微机构统一起来

厚度：2(暗)+( 亮)+2 (暗) =

细胞质膜的主要功能概括如下：

(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;

(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；

(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；

(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；

(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;

质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白

虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)

膜蛋白的提取与分离

欢迎共阅膜蛋白的提取与分离

膜蛋白的分离

一、简介：

1细胞质膜资料

1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成

"。

1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总

面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治

结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子

结构与超微机构统一起来

厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5

细胞质膜的主要功能概括如下：

(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;

(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中

伴随着能量的传递；

(3)提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；

(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；

(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;

质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白

虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤

全文共四篇示例，供读者参考

第一篇示例：

膜蛋白是位于生物膜上的一种蛋白质，它在细胞内外沟通信息，

调节物质的运输和细胞的形态结构等功能。鉴定膜蛋白的方法和步骤

对于研究细胞生物学和生物化学具有重要意义。下面将介绍一种常用

的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。

实验方法：

1. 细胞培养和膜蛋白提取：需要将感兴趣的细胞株培养至对数生

长期，然后采用适当的方法将细胞破碎并获得含有膜蛋白的细胞膜。

2. SDS-PAGE分析：将膜蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白分离出来。

3. 免疫印迹分析：将膜蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移到聚丙烯酰胺膜上，然后用特异性的抗体探测膜蛋白。

4. Western blot分析：用二抗结合辅助探测靶蛋白。

5. 膜蛋白鉴定：根据Western blot结果，确定膜蛋白的存在与否，并分析其表达水平。

实验步骤：

1. 提取膜蛋白：将细胞经过适当处理（如超声波破碎、离心等）后，得到含有膜蛋白的细胞膜，采用适当的方法（如亚硝酸铝沉淀法）沉淀膜蛋白。

2. 蛋白定量：用BCA或Bradford方法测定蛋白浓度。

3. SDS-PAGE电泳：将膜蛋白样品加入含有SDS的样品缓冲液中，加热变性，然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。

4. Western blot：将凝胶电泳后的蛋白转移到PVDF或nitrocellulose膜上，用特异性抗体探测膜蛋白的存在。

5. 二抗结合：将与特异性抗体结合的二抗与酶标记共同作用于蛋白，然后用化学发光或显色底物观察膜蛋白。

通过上述实验方法及步骤，可以较为准确地鉴定膜蛋白的存在与

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行：

1. 细胞收集：从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。可以使用细胞培养方法培养细胞，或者从活体组织中分离细胞。

2. 细胞破碎：将细胞用适当的方法破碎，以释放细胞内的蛋白。可以使用机械方法（如超声波破碎器或高压细胞击碎器）或化学方法（如洗涤液或界面活性剂）来破碎细胞。

3. 蛋白质提取：使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心，以去除细胞碎片和细胞核。随后，可以使用不同的方法来提取膜蛋白，例如溶解细胞膜并提取蛋白。

4. 蛋白质纯化：使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。

5. 蛋白质浓缩：将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。可以使用蛋白质浓缩技术，例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。

6. 蛋白质鉴定：利用蛋白质检测方法，如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等，确定提取的蛋白质的纯度和数量。

细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。

细菌总蛋白的提取方法

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法

一、从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)

1、自配裂解液( pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HC，l 2 mM EDTA, 100 mM NaC，l 0.5% Triton X-10Q调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100卩g/m溶菌酶，1卩l/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g 湿菌体。

2、将40ml菌液在12000g, 4C下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤 2 遍，沉淀加入1ml 裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w, 10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3 次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用

1%SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting 结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol 裂解液中分离总蛋白

1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8C下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTrizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min, 28C不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min, 28C下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol 加入2ml 洗液，室温放置20min, 2-8C下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml 无水乙醇，涡旋后室温放置20min, 2-8C下7500g离心5min,弃上清。