医疗器械初始污染菌检验

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初始污染菌检查

初始污染菌检查生物学检查初始污染菌检查空气中细菌总数检测方法物体表明和生产人员手细菌总数检测方法初始污染菌检测初始污染菌检测目的:保证灭菌的效果，确定灭菌剂量，监控灭菌过程的有效性。

引用标准: GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准中华人民共和国药典2010版附录微生物限度检查法 GB15980-1995 规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。

对一次性使用医疗用品(包括灭菌和消毒的一次性使用医疗用品)生产企业中生产、装配、包装车间(空气中细菌总数检查方法)等生产过程和生产工人手提出卫生要求的质量控制。

检测环境和检验量在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行。

洁净区设置可在微生物室操作各类产品每批随机抽样10件样品(10个包装) 方法主要步骤采样初始污染菌检测初始污染菌检测检验方法将每样取5份平行样(取一份样品，根据限值制备好供试液后，取5份1:10，取5份1:100，取5份1:1000，……) 初始污染菌检测结果计算公式:平均菌落数×稀释倍数菌数菌数/每件次(或g) ―――――――――――――――――――件次或重量(g) 注意事项: 供试品的取样必须在万级环境中100级净化条件下，无菌操作，防止污染。

应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。

产品初始污染菌数限值: 灭菌产品管道类内腔?10cfu/件次，外部?100cfu/件次，非管道类?100cfu/件次，敷料类?100cfu/g;消毒产品?1000cfu/件次或重量(g) 初始污染菌检测细菌计数细菌计数先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5-10倍的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏(可辅助菌落计数器)记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数(每个稀释度的5个平板值，相加后除以5)。

若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。

初始污染菌检验规程

初始污染菌检验规程初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。

2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。

4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。

2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。

2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。

若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。

3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。

阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

制备2个平板均不得有菌生长。

3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。

2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。

编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。

第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。

2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。

3生物负载测定方法A.1概要A.1.1生物负载测定，可使用不同的方法内容。

初始污染菌检测

用？ml 氯化钠-蛋白胨缓冲液浸提？小时（包括最内层包装的内壁）
-所需供试液的用量和浸提时间需验证处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕
动、超声、涡旋混合、搅拌
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举例—振动
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小型医疗器械可以投入无菌的自封袋中，加入缓冲液充分振动。
另外，用缓冲液冲洗内包装袋的内壁。并与产品缓冲液相混。
A 试验组
供试液+试验菌（50~100cfu）
B 菌液组
试验菌（50~100cfu）
C 供试品对照组
D缓冲液对照组缓冲液+试验菌（50~100cfu）
(A-C)/B>70%
D/B>70%
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菌落计数报告规则—平板法
选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落数在 30~100之间的稀释级作为报告菌落数的依据。
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薄膜过滤法
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培养
药典中的培养条件：细菌 30-35℃ 48h 霉菌、酵母菌 23-28 ℃ 72h 必要时，可适当延长培养时间至5-7天
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菌落计数
计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。
菌落特征： ⑴ 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、
淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC(氯化三苯基四氮唑试剂)，菌落为红色） ⑵ 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。 ⑶ 大小差异很大。
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医疗器械的无菌和初始污染菌检验

平板划线法-曲线法：将挑取有样品接种环在平板培养基上作连续划线。
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
血琼脂平板上金黄色葡萄球菌（大金黄色菌落）
在划线过程中，细胞逐步分散，培养后可形成单个菌落。
器械的无菌和初始污染菌检验
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培养基适用性检验
定时移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃进行保留并间隔一定时间进行移植培养一个短期菌种保藏方法。
细胞核及核膜、核仁，直径普通为1μm ~ 10μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善，有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径普
通为10μm ~ 100μm。
器械的无菌和初始污染菌检验
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医疗器械无菌检验所需设备
超净工作台
器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械的无菌和初始污染菌检验
医疗器械无菌检验技术
器械的无菌和初始污染菌检验
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什么是无菌检验法？
用于检验要求无菌医疗器械是否无菌一个方法。若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在该检验条件下未发觉微生物污染。
无菌试验目标：将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。还应该含有高度责任心和严谨细致工作作风。
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法环境要求
器械的无菌和初始污染菌检验
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无菌检验法环境要求
隔离系统
器械的无菌和初始污染菌检验

初始污染菌检验规程

初始污染菌检验规程
背景介绍：
在实验室实验过程中，初始污染菌检验是非常重要的步骤。

初始污染菌指的是
空气、水、试剂或其他材料中存在的微生物。

检验规程的制定能够帮助实验室准确检测和控制初始污染菌的存在，确保实验结果的准确性和可靠性。

检验标准：
初始污染菌检验应符合国家相关标准要求，例如《实验室建设与管理规范》中
对于实验室环境洁净度的规定。

检验过程中应注意保持环境清洁，严格按照检验程序进行操作，确保检测结果的准确性。

检验步骤：
1.准备工作：检验前应检查所需试剂、工具和设备是否齐全，确保实
验室环境干净整洁。

2.取样：根据检验对象的不同，采取相应的取样方法，避免外界污染
的介入。

3.样品处理：对样品进行适当处理，如过滤、稀释等，以便得到合适
的实验样品。

4.培养：将样品接种在适当的培养基上，并在合适的环境条件下培养，
观察细菌的生长情况。

5.检测分析：通过显微镜观察细菌的形态特征，或进行生物学、生化
等相关检测，确定是否存在初始污染菌。

6.记录结果：将检验结果详细记录，包括检测方法、结果数据、存在
问题等，便于回顾和分析。

结论与建议：
初始污染菌检验是确保实验室环境洁净度和实验结果准确性的重要步骤。

在检
验过程中，应严格按照规程操作，保持实验样品的完整性和准确性。

实验室应建立健全的质量管理体系，加强对初始污染菌的监测和控制，不断优化检验方法，提高检测效率和准确性，确保实验室的质量与信誉。

医疗器械无菌和初始污染菌检

— ≤10 000
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
尿布等普通级消毒级
— ≤10 000
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。
初始污染菌的检验
03
02
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
超净工作台
恒温培养箱（至少2台）
压力蒸汽灭菌器
电热干燥箱
集菌仪
电子天平
光学显微镜
环境及人员要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
需氧菌生长
厌氧菌生长
培养基:
改良马丁培养基： 23℃ ~ 28℃培养14天
培养基:
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
01
02
灵敏度检查所用菌种（药典2010版规定）金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉
待琼脂凝固后翻转平皿置35 ℃±2 ℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
取上清液共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL供试液
稀释度 5
医疗器械的无菌和初始污染菌检验相关标准

初始污染菌检查

菌数/cm2=
平均菌数稀释倍数采样面积c（ m2）
菌数/每只手=平均菌数×稀释倍数
谢谢
对生产人员手采样：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹10次后，将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的试管中。
检验方法和结果计算
将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，对每个稀释度(取3个稀释度)，分别取1ml放于灭菌平皿内，每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱倒置培养24h，观察结果，取菌落数为30～300的平板计算，求出平均菌落数。
2. 2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10 的供试液。
3. 3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。作为供试液。
4. 4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2019年规定进行)
6、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数为“不可计”时，应表明样品的稀释度
细菌计数结果及报告方法
例次 1 2 3 4 5 6
不同稀释度的平均菌落数
10-1
10-2
10-3
1365
164
20
2760
初始污染菌检测
供试液制备
•推荐的制备方法
样品制备
用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取
10g，移入100ml灭菌生理盐水中，不时振摇。作为1：10供试液。
纱布模拟
供试液制备
供试液10倍递减稀释。尽量避免丝线等杂物的混入。

初始污染菌方法验证

初始污染菌方法验证公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]1.目的验证产品初始污染菌数的试验方法。

2.范围适用于质量部门对产品初始污染菌数验证试验的检测。

3.职责质量检验人员负责执行此规程。

4.依据标准及相关文件2010 版《中华人民共和国药典第二部》附录Ⅺ J 微生物限度检查法GB/《医疗器械的灭菌-微生物学方法-第一部分产品中微生物数量的估计》GB15980-2009 《一次性使用医疗用品卫生标准》5.试验产品6.注意事项本操作应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的无菌操作台内进行。

操作过程应尽量避免任何可能使结果发生偏差的污染。

无菌操作台必需定期进行洁净度检测??试验前提前开紫外灯15min 后方可进行实验操作。

过滤器、滤膜、镊子以及无菌设备杯使用前应进行灭菌??使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。

7.器材与试剂器材35℃恒温培养箱、23℃恒温培养箱、灭菌器、洁净工作台、无菌过滤装置、镊子、剪子、电子天平、移液器、接种环稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后按说明书要求进行灭菌。

pH 无菌氯化钠溶液—蛋白胨缓冲液%无菌氯化钠溶液。

培养基营养琼脂培养基：按说明书方法保存配制。

玫瑰红钠琼脂培养基：按说明书方法保存配制。

改良马丁液体培养基：按说明书方法保存配制。

改良马丁琼脂培养基：按说明书方法保存配制。

营养肉汤培养基：按说明书方法保存配制。

8.计数方法的验证试验当建立产品初始污染菌数检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：以确认所采用的方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌的测定。

若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为0代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

医疗器械初始污染菌检验

起草人/日期审核人/日期批准人/日期分发部门品质部1、目的检测产品灭菌前实际带菌（活的微生物群）的数目。

2、适用范围适用于本公司产品初始污染菌的检测。

3、职责由品管部负责执行实施。

4、检测程序4.1检验频次：车间生产的产品三个月做一次初始污染菌检验，至少抽取3个批次进行检测，对不同车间和材质的产品进行轮流循环抽样。

标准作业规程标准要求4.2取样方法4.3试验方法4.3.1配制洗脱液4.3.1.1称量4.3.1.2溶解4.3.1.3洗脱液分装用电子太平准确称取9gNaCl 。

用灭菌镊子于同一个批次三个大包装（三个以上员工的产品）中至少随机抽取90g 或抽取12个最小销售包装样品，1/3样品用于检测,1/3样品用于留样，另1/3样品(可就地封存)必要时用于复检。

装入无菌的塑料袋中，立即密封好（塑料袋上应标示产品的生产日期、定单编号、规格、生产车间、员工姓名、产品代号）并立即送检，送检中不得打开塑料袋，三分之一用于测试，三分之一用于留样，三分之一必要复试。

样品最小包装不应有破损,检验前不得开启。

将已称好9gNaCl 溶于1000ml 蒸馏水中，充分搅拌直至完全溶解。

4.3.1.4洗脱液灭菌4.3.2样品处理4.3.2.1样品制备4.3.2.2 样品混匀4.3.2.3吸取样液4.3.2.4平板倾注法称取9gNaCl溶于1000ml蒸馏水中,然后用锥形瓶分装，每瓶100ml（可以根据实验的需要分装不同体积的液体）。

在 100 级净化工作台条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装，从每个包装中随机取样，准确称取l0g土1g样品.用灭菌剪刀和镊子把样品剪碎.样品剪碎后用灭菌镊子加入到100ml的洗脱溶液中，将装有样品的锥形瓶靠压在旋涡混合器上的施转垫上振荡（2800次/min）2min。

如被检样品是吸水量较高的材料而导致不能吸出足够样液时，洗脱液量可按每次50ml,递增，直至能吸出足够测试在无菌操作台中，待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液,用灭菌移液管从锥形瓶中吸取1ml样品的洗脱液转移到无菌平皿。

1、医疗器械无菌和初始污染菌检验

无菌检查法培养及观察
上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
改良马丁培养基4支：分别接种小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养5天。
白色念珠菌
黑曲霉
方法验证试验：结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
无菌检查法环境要求
无菌检查法环境要求
隔离系统
无菌检查法环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。 TSA琼脂平皿在30℃~ 35℃培养48h证明无菌取3只放无菌操作台或超净工作台平均位臵打开上盖，暴露30min后盖好 3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个
供试品的无菌检查
阴性对照（目的是验证试验是否存在污染）：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。阳性对照（目的是验证试验可靠性，防止假阴性）：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu ，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48 ~ 72小时应生长良好。

初始污染菌检验操作规程

初始污染菌检验操作规程方法：每个培养皿上菌落数超过300个，以最近的一个稀释级计数。

每个培养皿上菌落数在30-300个之间，以最近的两个稀释级计数，如最近的两个稀释级计数相差大于10倍，则应重新进行稀释。

4.6.3结果判定：若每个培养皿上菌落数均小于规定标准，则样品合格；若有一定数量的培养皿上菌落数超过规定标准，则进行进一步检验。

若进一步检验结果仍然超过规定标准，则样品不合格。

初始污染菌检验操作规程目的：本规程的目的是为了测定样品细菌总数，以判断样品细菌污染的程度，并评估生产单位的卫生状况，为下一步的灭菌提供参考依据。

适用范围：本规程适用于所有需要消毒灭菌前的产品和洁净车间。

作业条件：1.无菌检测需要在洁净度为100级单向流空气区域内进行，严格遵守无菌操作，避免污染。

2.超净台及工作台面必须进行洁净度验证。

作业方法与步骤：1.制作营养琼脂培养基，并按要求培养16-18小时后，检查无菌生长方可使用。

2.进行无菌室洁净度验证。

3.进行产品采集与样品处理，制备供试液。

4.进行供试液的10倍递减稀释。

5.进行接种检验。

6.进行培养。

结果与判定：1.计数方法：每个培养皿上菌落数超过300个，以最近的一个稀释级计数。

每个培养皿上菌落数在30-300个之间，以最近的两个稀释级计数，如最近的两个稀释级计数相差大于10倍，则应重新进行稀释。

2.结果判定：若每个培养皿上菌落数均小于规定标准，则样品合格；若有一定数量的培养皿上菌落数超过规定标准，则进行进一步检验。

若进一步检验结果仍然超过规定标准，则样品不合格。

菌落计数是食品微生物学检验中常用的方法之一。

在进行菌落计数时，需要注意以下基本规则。

首先，不宜采用菌落层片状生长的平板。

其次，计数符合要求的平板上的菌落，按照公式计算结果。

具体而言，菌数除以每件次（或g）的重量，等于件次或重量（g）。

选取平均菌落数在30～300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。

如果只有一个稀释级平均菌落数在30～300之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数进行报告。

2024初始污染菌实验方法验证

2024初始污染菌实验方法验证
2024年初始污染菌实验的方法验证可以包括以下几个方面的内容：
实验目的、实验设备和材料、实验步骤、实验结果及讨论等。

实验目的：验证2024年初始污染菌实验的方法是否可靠、有效，能
够准确测定菌的数量和种类。

实验设备和材料：实验设备包括培养皿、培养基、试管，实验材料包
括空气样品、表面拭子、蘑菇、硒酸纸等。

实验步骤：以下为可能的实验步骤，但实际步骤可能因具体实验设计
而有所不同。

1.收集空气样品：在实验环境中放置一定数量的培养皿，在一定时间
内吸取一定体积的空气样品。

2.采集表面拭子：使用含有菌落细栏的纹理拭子通过轻轻刷拭的方式
采集表面的微生物。

3.采集其他样品：根据具体实验设计，采集其他可能受污染的样品，
如食品、水源等。

4.制备培养基：按照一定比例配制适当的培养基，可以包括营养琼脂、血琼脂等。

5.接种培养基：将收集到的空气、表面拭子等样品分别接种到培养基中。

6.孵育培养基：将接种好的培养基置于恰当的温度和湿度条件下，进
行孵育。

7.菌落计数：根据特定的方法和标准，对培养基上的菌落进行计数，并记录下来。

8.分离和鉴定菌株：对菌落进行分离，选取单个菌落进行进一步的培养和鉴定，可以通过形态学、生理生化等方法鉴定。

实验结果及讨论：根据实验结果，分析验证的方法在初始污染菌实验中的可靠性和准确性，讨论可能存在的问题和改进方向，提出实验方法的优化建议。

总结：通过以上实验验证方法，可以确保2024年初始污染菌实验结果的准确性和可靠性，为后续的相关研究和实验提供了基础数据和方法参考。

ISO13485体系初始污染菌检验规程

初始污染菌检验规程1.目的：制订初始污染菌检验规程，对从事检测的操作人员进行培训指导按检测规程操作。

2.范围：本方法适用于一次性使用无菌医疗器械灭菌前染菌量的检测。

3.术语和定义：无4.职责：质量部负责实施。

5.内容：5.1仪器电子天平、电热恒温干燥箱、净化工作台、压力蒸汽灭菌器、电热恒温水浴锅、恒温培养箱、电炉。

5.2器具烧杯、量筒、三角瓶(带硅胶塞)、试管(带硅胶塞)、酒精灯、手术剪刀、培养皿、刻度吸管、薄膜过滤器5.3 培养基、试剂：胰酪大豆胨琼脂培养基、无菌生理盐水5.4 试验前的准备5.4.1胰酪大豆胨琼脂培养基的制备：按产品说明书进行配制、灭菌，供细菌培养记数用。

5.4.2 无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）的制备：a．配制：称取9.0g氯化钠加入蒸馏水溶解使成1000ml。

b. 分装：分装于试管中，装量不得超过试管容量的2/3，盖上硅胶塞，包好。

c．灭菌：121℃20分钟高压灭菌。

5.5 取样方式a）灭菌前随机抽取样品；b）抽取不适于销售的产品，如废料或不合格品（即已经过各关键工序的生产过程阶段（包括清洗和包装过程）的产品）；c）初包装材料可用无菌手续取样随即取10套/件（卷料无菌手续取100cm2）。

注:以上方式可根据产品具体情况择其一操作；5.6 取样频率当月生产各产品至少抽取一批次；每批来料初包装材料最少抽取一次。

5.7 试验步骤5.7.1 消毒：将待检的产品外包装用酒精棉擦拭后，放于经擦拭的垂直式超净工作台面，紫外灯照射0.5小时以上。

5.7.2 供试液的制备：按无菌操作法制备供试液，制备后应在2小时内进行检测；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

5.7.3用无菌注射器吸取10～100ml无菌生理盐水，注入样品管内往返振荡5次；外部用无菌注射器吸取10～100ml无菌生理盐水冲洗管壁；内外壁如此各重复二到三次。

分别将供试液注入无菌容器中，分别检测。

5.7.4 以上制备的供试液直接或稀释后采用薄膜过滤法、平板计数（平皿法）或其他适宜方法进行分析检查。

3、医疗器械的无菌和初始污染菌检验

铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC（B） 10 104］
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis )
［CMCC（B） 63 501］
生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes)
[CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candidaalbicans)
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风。
无菌检查法环境要求
无菌检查法环境要求
隔离系统
无菌检查法环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。
TSA琼脂平皿在30℃~ 35℃培养48h证明无菌
取3只放无菌操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好
平板划线法-曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
培养基的适用性检查
血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。
培养基的适用性检查
定期移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃ 进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。
无菌检查法试验前准备
配制培养基所需器具:
无菌检查法试验前准备
常用器具与稀释液:
无菌检查法试验前准备
培养基:
无菌检查法
硫乙醇酸盐流体培养基:
在供试品接种前, 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则 ,须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却,只限加热一次，并应防止被污染。其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培养14天。

(019)初始污染菌检验方法

通过检验产品的初始污染菌，了解产品在生产过程中受微生物的情况，以便更好地提高产品质量。

2 范围本方法适用于本公司生产的一次性输液器、注射器、以及输液器的零配件，各类导管、纱布块等的初始污染菌的检验。

3 依据GB 15980-2002 一次性使用医疗卫生用品标准中华人民共和国药典2005版第二部GB 8368-2005 一次性使用输液器GB 1997.1-2005 （ISO 11737-1:1995）医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物总数的估计4 要求灭菌产品管道类内腔污染菌数：应≤10cfu/件次，外部应≤100cfu/件次；非管道类应≤100cfu/件次；敷料料应≤100cfu/g；消毒产品应≤1000cfu/件次或重量（g），具体见表1。

55.1 营养琼脂培养基的配制：成份：NaCl 5g胨 10g琼脂 15-20g制法：取牛肉膏3g，加水1000ml，配制成肉浸液，将胨、NaCl、琼脂加入肉浸液内，微温溶解后，调节PH值，为弱碱性煮沸，滤清，调节PH值使灭菌后为7.2±0.2，分装后置压力蒸汽灭菌器内于115℃灭菌30min即得。

5.2 样品采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。

5.3 供试液制备5.3.1.供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。

作为1：10的供试液。

5.3.2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。

作为1：10的供试液。

5.3.3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2，加入灭菌生理盐水100ml。

作为1：10的供试液。

5.3.4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2005年规定进行)5.3.5.1内腔供试液制备：每套输液（血）器内腔注入20mL灭菌生理盐水,振摇5次，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。

作为1：1的供试液。