淋巴细胞转化试验(MTT)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验1.实验步骤：1.1.调整淋巴细胞浓度：a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min；b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料离心管；c)离心1500rpm, 5min；d)用Hank’s液洗2次；e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡；f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。
（假定4个大方格内总数为N，则该细胞悬液的浓度为n=105*N）1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。
以100μl/孔加入96孔细胞培养板中。
（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。
）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。
不同品种的动物也有一定的不同。
1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。
细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。
1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。
每过24小时需取出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。
1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。
1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去细胞培养液，纸巾吸干。
加入DMSO，150ul/孔。
充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解）1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴细胞转化实验原理
淋巴细胞转化实验原理
淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞实验技术，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
该实验主要通过处理淋巴细胞，使其进行转化和增殖，从而获得更多的细胞进行后续的功能分析和研究。
实验的原理基于淋巴细胞的自然特性和生理过程。
淋巴细胞是一类免疫细胞，起着重要的免疫调节和防御功能。
在正常情况下，淋巴细胞处于休眠状态，只有在遇到外源性刺激或免疫细胞间相互作用的信号刺激下，才会转化为活化状态，开始增殖和分化。
在淋巴细胞转化实验中，常用的处理方法是给予刺激物或相关信号物质。
这些刺激物可以是抗原、细胞因子、化合物或重组蛋白等。
通过刺激淋巴细胞，在体外条件下模拟体内的免疫应答过程。
刺激物与淋巴细胞相结合后，能够激活细胞上的相应受体和信号通路，从而引发一系列的生物学反应。
在刺激的作用下，被处理的淋巴细胞开始进入细胞周期，细胞开始增殖和分化。
通过细胞分裂和子细胞的形成，最终得到更多的活化淋巴细胞。
这些活化的淋巴细胞可以进一步用于功能分析、免疫学实验、药物筛选等。
需要注意的是，在进行淋巴细胞转化实验时，应严格控制实验条件，包括温度、细胞培养基成分、刺激物浓度和时间等。
不同类型的淋巴细胞对不同刺激物的响应可能存在差异，因此实验前应先对要研究的淋巴细胞类型进行文献调查和探索性实验，以确定最适合的刺激条件。
总之，淋巴细胞转化实验通过处理和刺激淋巴细胞，使其从休眠状态转化为活化状态，以获得更多的活化细胞进行功能分析和研究。
实验的原理基于淋巴细胞的生物学特性和免疫功能，需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性。
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。
MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。
MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。
甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。
MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。
MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。
2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。
3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。
4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。
5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。
然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。
通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。
6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。
7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。
DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。
8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。
总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告
《淋巴细胞转化实验报告》
淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内起着重要的免疫监测和调节作用。
淋巴细胞的转化实验是一种常用的实验方法，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
在本次实验中，我们对淋巴细胞进行了转化实验，并得到了一些有趣的结果。
首先，我们从实验动物的淋巴组织中分离出淋巴细胞，并将它们培养在含有适
当营养物质的培养基中。
随着培养时间的延长，我们观察到淋巴细胞的数量逐
渐增加，并且它们的形态也发生了变化。
在显微镜下观察，我们发现淋巴细胞
的形态由圆形变为椭圆形，胞质增加，胞核变大。
这表明淋巴细胞在培养基中
得到了充分的营养和生长条件，从而发生了细胞转化。
接下来，我们对转化后的淋巴细胞进行了功能性实验。
我们使用了一种常用的
淋巴细胞激活试剂，刺激转化后的淋巴细胞，然后观察它们的反应。
我们发现，转化后的淋巴细胞在受到刺激后，迅速产生了细胞因子，并且开始增殖和扩散。
这表明转化后的淋巴细胞具有了充分的免疫活性，并且能够有效地应对外界的
刺激。
最后，我们对转化后的淋巴细胞进行了表型分析。
我们使用了流式细胞术对细
胞进行了分析，发现转化后的淋巴细胞表面的免疫分子表达水平显著增加，这
进一步证实了它们的免疫活性得到了提高。
通过本次实验，我们成功地进行了淋巴细胞转化实验，并得到了一些有意义的
结果。
这些结果不仅对于淋巴细胞的功能和活性有重要的启示，也为我们进一
步研究免疫细胞的活性和调节机制提供了重要的参考。
希望通过我们的努力，
能够为免疫学领域的研究和临床应用做出更大的贡献。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。
实验过程中，将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养，观察其细胞增殖情况，并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。
实验设备：1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5％DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤：1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片，加入10ml的淋巴细胞分离液中，用离心机将其离心5min，取上清液为淋巴细胞。
2.将淋巴细胞洗涤三次，倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。
重复该步骤3次，以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。
3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液（不含共同诱导剂），分别加入5% DMSO，共同诱导剂和一个对照组，分别孵育24h，48h和72h。
4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。
根据实验要求进行加药与相应的控制。
5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中，各包含80μl，进行形态学观察。
6.将淋巴细胞72h转移，在比色计中检测细胞增殖情况，计算得到相应的增殖指数（SI）。
实验结果：1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。
对照组：淋巴细胞间距等距，无细胞破裂或缺损。
5% DMSO：淋巴细胞受到较严重的损伤，细胞全部变形。
共同诱导剂：淋巴细胞形态多样性，出现组织块状聚集现象。
2.细胞增殖情况70h后，比色计检测增殖情况。
对照组：SI为15% DMSO：SI为0.4共同诱导剂（分析不同剂量）：(a) 0.01ug/ml：SI为1.8(b) 0.1ug/ml：SI为2.7(c) 1.0ug/ml：SI为2.1实验分析：淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程，在此过程中细胞数量增加。
转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
体外诱导转化中，加入化合物或病毒等诱导剂，以刺激细胞增殖。
本实验中，采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。
实验结果表明，共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用，而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。
mtt检测原理
mtt检测原理MTT检测原理MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测试剂，被广泛应用于生物医学研究中。
本文将介绍MTT检测的原理和应用。
一、MTT检测原理MTT检测原理是基于细胞代谢活性的变化而设计的一种细胞毒性测定方法。
MTT是一种黄色的晶体，可通过细胞内还原酶的作用而转化为紫色的结晶体形式。
这种还原酶主要是细胞内的线粒体呼吸链中的NAD(P)H脱氢酶。
MTT的转化过程主要包括以下几个步骤：1. 细胞摄取MTT：MTT溶液添加到细胞培养基中，进入细胞内。
2. 还原酶作用：细胞内的还原酶将MTT还原为紫色的结晶体。
3. 结晶体形成：紫色结晶体沉积在细胞内部的线粒体中。
4. 结晶体溶解：细胞溶解液（如DMSO）加入，将结晶体溶解。
5. 检测吸光度：通过读取样品的吸光度，可间接判断细胞的代谢活性。
二、MTT检测的应用MTT检测广泛用于细胞毒性和细胞增殖活性的研究中，可应用于药物筛选、毒理学评价、细胞增殖和细胞凋亡等方面。
1. 药物筛选：MTT检测可用于评估药物对细胞的毒性作用。
通过给予不同浓度的药物处理细胞，再进行MTT检测，可以确定药物的毒性效应和半数致死浓度（IC50）。
2. 细胞增殖：MTT检测也可用于评估细胞的增殖活性。
细胞在不同处理下，如药物刺激、基因敲除等，通过MTT检测细胞的活性变化，从而研究细胞增殖的调控机制。
3. 细胞凋亡：MTT检测可用于评估细胞凋亡的程度。
凋亡细胞的代谢活性降低，通过MTT检测细胞的吸光度变化，可以间接判断细胞凋亡的程度。
4. 毒理学评价：MTT检测可用于评估化学物质对细胞的毒性作用。
通过给予不同浓度的化学物质处理细胞，再进行MTT检测，可以确定化学物质的毒性效应和半数致死浓度（IC50）。
5. 细胞代谢活性研究：通过MTT检测细胞的代谢活性变化，可以研究细胞代谢的调控机制，如细胞内能量代谢的变化等。
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理步骤注意事项MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）实验是一种间接法测定细胞的代谢活性的方法。
MTT是一种黄色的溶液，在细胞内会被活细胞的线粒体内还原为紫色的结晶形式。
这些紫色结晶通过一定的溶解步骤转变为紫色的溶液，并使用酶标仪测量其吸光度。
吸光度的变化可以反映细胞的增殖和活性水平，从而评估药物或物质的细胞毒性。
1.细胞培养：选择需要研究的细胞株，并使用细胞培养基将其培养至对数生长期。
2.细胞接种：将对数生长期的细胞用细胞培养基洗涤，获得单细胞悬浮液，并在96孔板中接种相应的细胞密度。
3.处理药物：根据实验需求，选择适当浓度的药物或化合物，并将其加入每个孔中。
4.处理时间：根据需求和实验目的，将药物处理时间设定为不同的时间段。
5.加入MTT溶液：在处理药物和处理时间后，将MTT溶液加入每个孔中，并使其充分与细胞接触。
6.溶解晶体：处理一段时间后，将培养基和MTT溶液完全吸取，然后添加溶解晶体溶液，使晶体溶解。
7.检测吸光度：待溶解晶体完全溶解后，使用酶标仪测量每个孔的吸光度，并将结果记录下来。
8.数据分析：根据吸光度的变化，可以计算得到药物对细胞的毒性，评估药物或物质的效果。
1.培养条件：选择合适的细胞培养基和培养条件，确保细胞能够保持良好的生长状态。
2.细胞密度：将细胞密度恰当控制在合适范围内，避免过度或不足，影响实验结果。
3.药物浓度：选择适当的药物浓度范围，避免浓度过高或过低，影响实验的结果。
4.处理时间：根据需求和实验目的，选择合适的处理时间，使药物对细胞产生明显的影响。
5.溶解晶体溶液：使用溶解晶体溶液时，要充分搅拌使晶体完全溶解，避免气泡产生。
6.数据分析：对实验结果进行正确的数据分析，根据实验的目的和要求进行合理解读。
总结：MTT实验通过将MTT溶液与细胞相互作用，最终通过吸光度的变化来评估药物或物质的细胞毒性。
MTT法检测淋巴细胞
9.除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放 孵箱15分钟溶解结晶。 10.至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值， 就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选 用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇， 则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
现代应用 实验原理
实验步骤
注意事项
细胞筛 选培养
药物药 效实验
现代 应用
药物毒 性检测
基因工 程
实验原理：
1. MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基 四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 2.检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲臜结晶 ，用酶联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物 活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 淋巴细胞体外转化代表着细胞免疫功能，因此测定 淋巴细胞体外增殖反应是研究细胞免疫功能的重要 手段和指标。
5. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来， 导 致每孔中的细胞数量不等，吹打次数100左右，就可以 吹打均匀了。 6. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹 下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 7. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现 细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆， 一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分 散会产生接触抑制，影响细胞的生长。 8. 96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于 具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致 培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同， 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。
淋巴细胞转化实验实验报告
淋巴细胞转化实验实验报告淋巴细胞转化实验实验报告研究背景•淋巴细胞转化实验是一项常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
•该实验可以模拟淋巴细胞在体外受到刺激后的免疫应答，探索淋巴细胞的增殖和分化过程。
实验目的•通过淋巴细胞转化实验，了解淋巴细胞的活化和增殖能力。
•探究不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响，如不同抗原、细胞因子等。
实验材料和方法•材料：新鲜淋巴细胞、RPMI-1640培养基、抗原、细胞因子等。
•方法：1.收集新鲜淋巴细胞，并进行细胞计数。
2.将淋巴细胞与培养基混合，在适宜的培养条件下培养。
3.接种不同刺激条件的实验组和对照组。
4.每隔一定时间，观察和记录细胞的形态变化、增殖情况等。
5.根据实验需要，进行细胞活性检测、流式细胞术等实验。
实验结果•不同刺激条件下，淋巴细胞转化率和增殖能力存在差异。
•特定抗原或细胞因子的刺激可以显著增强淋巴细胞的转化能力。
•细胞形态学观察显示：活化的淋巴细胞具有较大的体积和丰富的浆质。
实验讨论•淋巴细胞转化实验结果表明淋巴细胞对刺激条件敏感。
•抗原或细胞因子的刺激可以模拟免疫应答过程，有助于研究免疫系统的功能和异常。
•实验结果为淋巴细胞转化实验提供了一定的参考依据，可进一步扩展研究方向和方法。
结论•淋巴细胞转化实验是一项重要的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
•细胞转化实验结果显示不同刺激条件对淋巴细胞转化能力具有影响，这为进一步研究免疫系统提供了指导。
以上是本次淋巴细胞转化实验的报告，请查阅。
实验验证实验设计•实验组：将淋巴细胞与特定抗原处理，观察转化情况。
•阴性对照组：将淋巴细胞与无刺激物处理。
•正性对照组：将淋巴细胞与活化剂处理。
实验操作1.材料准备：–收集新鲜淋巴细胞。
–准备适宜培养基、抗原、细胞因子和活化剂。
2.细胞处理：–取适量淋巴细胞，计数并调整细胞浓度。
–实验组：将淋巴细胞与特定抗原处理，按照实验要求浓度进行处理。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
mtt实验方法
mtt实验方法MTT实验方法引言MTT实验方法是一种常用的细胞代谢活性测定方法，通过测定细胞的还原型三甲基四氮唑盐（MTT）的代谢能力来评估细胞的活力和增殖能力。
本文将介绍MTT实验方法的原理、步骤和注意事项。
一、原理MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色化合物，能够被细胞内的还原酶还原为紫色的可溶性晶体。
MTT实验利用细胞的代谢活性将MTT还原为紫色产物，通过测量产物的光密度来评估细胞的活力和增殖能力。
二、步骤1. 培养细胞将待测细胞种植在适当的培养基中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度达到要求。
2. 处理样本根据实验需要，给予细胞不同的处理，如药物处理、基因沉默、过表达等。
3. 添加MTT试剂将培养基中的MTT试剂按照一定比例（一般为0.5mg/mL）加入到培养皿中，使细胞与MTT试剂充分接触。
4. 孵育细胞将培养皿放回培养箱中，孵育一定时间（一般为2-4小时），使细胞内的还原酶将MTT还原为可溶性晶体。
5. 溶解晶体将培养皿中的培养基倒掉，加入适量的溶解剂（如DMSO）将晶体溶解，形成紫色液体。
6. 测量光密度将溶解后的液体转移到96孔板中，使用酶标仪或分光光度计测量其光密度（一般在570nm波长下），光密度值越高，代表细胞活力越高。
三、注意事项1. MTT试剂需避光保存，使用前需保持干燥。
2. 实验过程中需严格遵守无菌操作，避免细胞污染。
3. 孵育时间需根据实验需要进行调整，过短的时间可能导致MTT 还原不完全，过长的时间可能导致背景干扰增加。
4. 为减少实验误差，建议设置空白对照组和阴性对照组。
5. 在测量光密度前，需确保晶体完全溶解，否则会出现误差。
结论MTT实验方法是一种简便、可靠的细胞代谢活性测定方法。
通过测量细胞对MTT试剂的还原能力，可以评估细胞的活力和增殖能力。
免疫淋巴细胞转化实验与MTT法
淋巴细胞转化实验与MTT法一、材料1.普通材料：(1)RPMI 1640细胞培养液。
(2)抗生素：青霉素、链霉素、（按100u/ml加入培养液中）。
(3)0.1%植物血凝素(PHA).2.MTT,二甲基亚砜。
3.96孔培养板、酶联免疫检测仪、超净工作台、刻度吸管。
二、实验步骤及方法1.无菌操作，取淋巴细胞分离法分离的淋巴细胞致细胞悬液，调整浓度106个细胞/ml，按100μl/孔加入96孔培养板中，每一份淋巴细胞悬液分6个孔，设置实验组3孔加PHA，阳性对照3孔不加PHA。
↓2.实验组中每孔加含RPMI 1640培养液100μl（含PHA100μg/ml）。
↓3.37。
C,5%CO2 培养箱中培养72h，每日摇动数次。
↓4.培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液100μl，加入100μl不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续培养4h。
↓5.培养结束后每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀、振荡溶解10min，使紫色结晶完全溶解。
同时设置调零孔RPMI 1640（不含小牛血清培养液100μl，MTT 10μl，二甲基亚,200μl），置酶标仪（主波长570nm，辅助波长630nm）上测OD570。
↓6.计算刺激指数（SI）,SI=实验组OD570均值/阴性对照组OD570均值，以SI的高低来判断淋巴细胞的转化程度。
三、实验注意事项1.选择适当的细胞接种浓度，一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定，一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
t淋巴细胞转化实验报告
t淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种体外培养方法，用于研究免疫细胞对不同物质的反应，包括抗原、细菌、病毒等。
本实验采用人体外周血淋巴细胞作为材料，通过添加激动剂使其转化为体外培养的淋巴母细胞，然后进行免疫学研究。
本报告将对本实验的过程和结果进行描述和分析。
实验步骤1.收集外周血从正常成年人的静脉血收集外周血，将其分装到离心管中。
用 PBS 冲洗红细胞，使淋巴细胞纯化后采集上清液。
2.细胞数计数采用血细胞盘进行计数，每个实验需要约 4-6万个淋巴细胞，取相应数量的细胞用1640 培养基含有 10% 胎牛血清的细胞密度中稀释。
3.淋巴细胞培养将稀释的淋巴细胞在细胞密度2 × 10^5/ml 的情况下播种在 96 或 48 孔板的深孔中，然后加入不同的激动剂，如激活剂、抑制剂、细胞因子等，同时添加乙酰溴芬酸作为负对照组。
4.腺病毒载体转染在淋巴细胞培养的第 2，3 天，加入适量的腺病毒载体（MOI 为 50），接种24 h 后用媒介液冲洗并更换新的培养液，然后让细胞继续培养。
5.淋巴细胞功能检测对于 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，通过检测它们的增殖和检测分泌的细胞因子的表达来评估激动剂的效应。
在体外转化过程中，通过荧光PCR技术检测核因子-κB 和JAK/STAT 信号通路的激活。
实验结果本实验采用血细胞盘计数，每个实验需要约 4-6 万个淋巴细胞。
将这些细胞培养在96 或 48 孔板的深孔中，添加不同的激动剂，保持在合适的细胞密度。
添加适当的激动剂，可以在淋巴细胞转化的过程中发现一系列的细胞反应，如细胞增殖，细胞因子的分泌等。
实验分析本实验是一项重要的免疫学研究方法，可以用于检测免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞）对外来物质的反应。
适当地添加激动剂，可以诱导免疫细胞在体外转化成淋巴母细胞，从而在体外模拟免疫反应过程。
在本实验中，采用了血细胞盘计数，这是一种传统的细胞计数方式。
T淋巴细胞转化实验
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
No Image
操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
刺激 (S 指 I实 对 ) 数 验 照 c cp p 均 均 m m 组 组 值 本 值 本 c c底 底 p p 值 值 m m
应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验 的原理及其操作方法。
实一验、原原理 理
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基 噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成 蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或 溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活 化的程度呈正相关。
采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试 验的原理及其操作方法。
淋巴转化实验报告
一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化的基本原理和实验方法。
2. 掌握淋巴细胞转化的检测方法，如MTT法和同位素法。
3. 通过实验了解淋巴细胞转化率与机体免疫水平的关系。
二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到有丝分裂原（如PHA、ConA）等刺激后，发生细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白和核酸合成增加等现象，最终转化为淋巴母细胞的过程。
淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平。
三、实验材料1. 实验试剂：淋巴细胞分离液、PHA、ConA、MTT、盐酸异丙醇、3H-TdR、肝素钠等。
2. 实验仪器：离心机、酶标测定仪、显微镜、细胞培养箱、移液器等。
3. 实验对象：人外周血淋巴细胞。
四、实验方法1. 淋巴细胞分离（1）采集抗凝血：每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。
（2）分离淋巴细胞：将采集到的抗凝血加入等体积的淋巴细胞分离液，混匀后置于离心机中以2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得淋巴细胞。
2. 淋巴细胞转化实验（1）MTT法：将分离得到的淋巴细胞悬液接种于96孔板，每孔加入PHA或ConA，使细胞浓度为1×10^6/ml。
在细胞培养箱中培养48小时后，加入MTT，继续培养4小时。
然后加入盐酸异丙醇溶解甲臜，用酶标测定仪测定OD值，波长为570nm。
（2）同位素法：将分离得到的淋巴细胞悬液接种于培养瓶，每瓶加入PHA或ConA，使细胞浓度为1×10^6/ml。
在细胞培养箱中培养48小时后，加入3H-TdR，继续培养24小时。
然后收集细胞，用液体闪烁计数仪测定放射性强度。
3. 结果分析根据MTT法和同位素法测定结果，计算淋巴细胞转化率。
淋巴细胞转化率=（实验组OD值或放射性强度-对照组OD值或放射性强度）/对照组OD值或放射性强度×100%。
五、实验结果1. MTT法实验结果：实验组OD值明显高于对照组，说明淋巴细胞在PHA或ConA 的刺激下发生了转化。
淋巴细胞转化实验报告
一、实验目的本实验旨在了解淋巴细胞转化的基本原理，掌握淋巴细胞转化实验的操作方法，并通过对实验结果的分析，评估机体细胞免疫功能。
二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到某些刺激物（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）的作用下，发生增殖、分化，转化为淋巴母细胞的过程。
淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法之一。
通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 试剂与耗材：植物血凝素（PHA）、小牛血清、培养液、显微镜、计数板、移液器、离心机等。
四、实验方法1. 采集小白鼠血液，分离淋巴细胞。
2. 将分离得到的淋巴细胞加入含有PHA的培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48小时。
3. 培养结束后，收集细胞，用固定液固定细胞，进行染色。
4. 在显微镜下观察淋巴细胞形态变化，计数淋巴母细胞数量。
5. 计算淋巴细胞转化率。
五、实验结果1. 观察到淋巴细胞在培养过程中，部分细胞体积增大，核染色质疏松，核仁明显，胞浆丰富，呈嗜碱性，符合淋巴母细胞特征。
2. 计算淋巴细胞转化率，本实验中淋巴细胞转化率为60.2%。
六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法，通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。
2. 本实验中，淋巴细胞转化率为60.2%，说明小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。
3. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。
七、结论本实验通过淋巴细胞转化实验，成功观察到了淋巴细胞在体外培养过程中的转化现象，并计算出淋巴细胞转化率。
结果表明，小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。
八、注意事项1. 实验操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。
3. 实验结果的分析应结合临床实际情况，综合评估机体的免疫功能。
细胞转化实验实验报告
一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的观察指标和结果分析方法。
3. 通过实验，观察不同刺激条件下淋巴细胞转化率的变化，了解细胞免疫功能。
二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞生物学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
在实验中，将外周血中的淋巴细胞与特异性抗原或刺激物共同培养，观察淋巴细胞在培养过程中的增殖情况。
淋巴细胞转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
自发转化是指在无外界刺激条件下，淋巴细胞自身发生的增殖；体外诱导转化是指在体外加入抗原或刺激物，刺激淋巴细胞增殖。
三、实验材料1. 实验动物：健康小鼠，体重20-25g。
2. 试剂：淋巴细胞分离液、Ficoll分层液、RPMI-1640培养基、小鼠抗人CD3单克隆抗体、PHA（植物血凝素）、Hoechst 33342染料、胰蛋白酶等。
3. 仪器：离心机、显微镜、培养箱、酶标仪等。
四、实验步骤1. 分离淋巴细胞：取小鼠外周血，加入Ficoll分层液，离心分离出单个核细胞层。
再用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。
2. 细胞培养：将分离出的淋巴细胞加入RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/ml。
将细胞悬液分装到24孔培养板中，每孔100μl。
3. 诱导转化：向部分孔中加入PHA，作为诱导剂；另部分孔不加诱导剂，作为对照。
将培养板放入培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养48小时。
4. 染色：向培养板中滴加Hoechst 33342染料，室温染色30分钟。
5. 观察与计数：在显微镜下观察细胞形态，计数每孔细胞总数和转化细胞数。
五、实验结果与分析1. 对照组细胞呈圆形，细胞核染色质均匀，细胞转化率低。
2. 诱导组细胞呈多边形，细胞核染色质致密，细胞转化率高。
结果表明，PHA能够有效诱导淋巴细胞转化，提高细胞免疫功能。
六、实验结论1. 本实验成功实现了淋巴细胞转化实验，掌握了实验操作步骤和观察指标。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞实验技术，用于研究淋巴细胞的功能和活性。
本实验旨在通过观察淋巴细胞的转化反应，探索其在免疫应答中的作用和机制。
实验结果对于理解免疫系统的功能和疾病发生机制具有重要意义。
实验方法：1. 实验材料准备：- 淋巴细胞：从小鼠或人类外周血中分离得到。
- 淋巴细胞培养基：含有适当的营养物质和生长因子，维持细胞的生长和活性。
- 合适的培养器具：离心管、培养皿等。
- 激活剂：例如PHA（植物血凝素）、ConA（凝集素A）等。
2. 实验步骤：- 收集外周血样本，离心分离淋巴细胞。
- 将淋巴细胞悬浮于培养基中，调整细胞密度。
- 在不同培养皿中分别加入激活剂和对照组，培养一定时间。
- 观察细胞形态变化和增殖情况。
- 使用流式细胞仪等技术，检测细胞表面标记物的表达情况。
实验结果：在实验中，我们观察到淋巴细胞在激活剂的刺激下发生了明显的转化反应。
在对照组中，淋巴细胞维持了原有的形态和数量，没有明显的增殖现象。
而在激活剂处理组中，淋巴细胞开始发生形态的改变，变得更加圆润和大型。
同时，细胞数量也明显增加，显示出细胞的增殖能力。
进一步的实验结果显示，激活剂处理组中的淋巴细胞表面标记物的表达发生了变化。
一些免疫相关的分子，如CD4、CD8等，表达量明显上调。
这表明淋巴细胞在转化过程中发生了细胞表型的改变，可能与其免疫功能的调节有关。
讨论与意义：淋巴细胞转化实验是研究免疫应答的重要手段之一。
通过观察淋巴细胞的转化反应，我们可以了解其在免疫系统中的作用和机制。
淋巴细胞转化是免疫应答的重要步骤之一，它参与了抗原识别、T细胞活化、细胞毒性和细胞介导的免疫应答等过程。
本实验结果的发现对于理解免疫系统的功能和疾病发生机制具有重要意义。
淋巴细胞的转化过程是免疫应答的关键环节，它与炎症、自身免疫疾病、感染性疾病等疾病的发生和发展密切相关。
通过研究淋巴细胞的转化反应，我们可以深入了解免疫系统在疾病中的作用，为临床治疗和疾病预防提供新的思路和方法。
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一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
2、淋巴细胞增殖反应：将5 105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。
置5％ CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。
37℃培养4-6小时。
4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。
，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。
实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。
因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。
以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。
(一)主要试剂材料1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。
2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。
所有细胞株均培养在含10%~20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。
(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。
(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 % CO2条件下培养，2~3d换液一次。
吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。
(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。
(四)TIL细胞的分离制备及其诱导(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。
(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。
(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。
(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。
(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。
(6)经1500~1800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。
(7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。
肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。
TIL则用含20% NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 ×106/ml。
(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2温箱培养3~4周，其间3~5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。
(五)LAK细胞和TIL活性的测定LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。
但所用靶细胞为对NK 不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。
常采用同位素法如51 Cr 释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。
本节介绍MTT比色法。
(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。
(2) LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。
设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。
同时将不同的白血病细胞株分别用20% NCS-RPMI-1640培养液调整至3 ×104一1×105/ml，取100ul 细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。
(3)将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2温箱孵育20h，其余步骤同IL-2生物活性测定。
(4)细胞毒性百分率(%)按下列公式计算ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值ODT=相应浓度单独靶细胞的OD三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：1) 取小鼠骨髓用BD染色液制成约2×108单细胞悬液2) 阻断：加入Ms Fc BlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞3) 加入Lineage Panel中biotin-mAb, 每种2ml/ 106细胞,冰上15min4) IMag buffer洗涤, 加Streptavidin磁珠, 5ml/ 106细胞, 6-12℃ 30min5) 放入磁场中8min, 将上清小心吸出、收集6) 试管移出磁场, 加buffer重悬阳性片断, 反复吹吸后放入磁场8min7) 小心吸出上清，一并收集8) 重复上两步操作收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞四、IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。
CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。
本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。
检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
（二）材料（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。
（3）IL-2标准品。
（4）PHA（200ug/ml）。
（三）方法（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
（2）IL-2生物活性测定①CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。