双酶切连接反应常见问题分析
双酶切连接反应之全攻略(
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双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。
实验前的准备工作：
1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。
2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。
3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。
4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。实验步骤：
1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。可以使用商用试剂盒或自制提取方法。
2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。
3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。
4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。这一步
骤可以检测酶切效率和特异性。将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点
1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当
的酶切位点。这些酶切位点应该满足以下几个要求：
-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；
-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；
-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。
2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合
的条件。一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和
反应温度。对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的
条件。
3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。
4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不
会出现过度切割的情况。反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围
内选择。
5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保
反应的成功。常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。
6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。这可能包括：
-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；
-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；
-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。
连接双酶切
连接双酶切
连接双酶切
PCR鉴定目的片段是否连接上表达载体
可能的原因，1.表达载体双切不充分，载体量太大，而酶又加的太少，酶切时间短
2.连接最好是12～16小时，因为你的目的片段和载体的浓度比，不是很合适
3.回收胶的问题
今天酶切时没有和空载体对比，
TE，含有EDTA，会抑制连接酶的活性
洗下来后要先确定一下浓度，浓度太低可定连不上
1：在使用 Wash Buffer 洗涤前，在柱子中加入少量 (200ul) 溶胶液。室温3-5 分钟后，离心。再接标准洗涤及以后操作。该操作针对胶块大的情况。
2：加入 Wash Buffer 后，静置 1-3 分钟后，再离心。
3：增加 Wash Buffer 的洗涤次数 (少量多次)。
胶的残留导致的问题不是单纯的胶残留问题，同时也会导致溶胶液中盐的残留 - 这似乎对连接影响更大。最好的解决方法是 1；当然，可能会导致得率的小量下降，但质量绝对好。
为了充分去除残留，总结，1.多加一步200ul溶胶液，2.加 Wash Buffer 前空柱离心 30 sec，3.Wash Buffer洗涤时静置及多次
柱子允许胶通过的量是有限的，胶越多或是浓度太大，残留就会更明显，所以切胶时应该尽量要小，假如过大的话分到两个柱子里应该比较好，另外就是溶胶液宁可多加也不能少加
首先要保证待测质粒的纯度,除PCR外,可以对重组质粒做两个双酶
切反应：1.ECoR I与Xh0 I双酶切; 2.选一个插入片段中特异存在的切点酶和质粒ECoRI下游到Xba1间的合适位点酶(插入片段中没有的),进行双切,结果可以预测到.每个双切反应包括酶1单切,酶2单切,双切三个反应,别忘了以空载体做对照.试试看.如果没有得到重组质粒只好再连接反应了.
双酶切
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）
双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
双酶切连接反应
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双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
双酶切失败的原因
双酶切失败的原因
引言：
双酶切是分子生物学中常用的技术手段，用于将DNA分子切割成特定的碎片。然而，在实际操作中，我们常常会遇到双酶切失败的情况。本文将探讨双酶切失败的原因，并提出相应的解决方案，以帮助读者更好地进行实验。
一、酶切位点缺失或变异
双酶切技术是基于酶切位点的特异性识别进行的。如果待切割DNA 分子中的酶切位点发生缺失或变异，将导致双酶切失败。这可能是由于DNA序列突变、DNA修复酶的作用或DNA样品质量差等原因造成的。解决此问题的方法是使用其他酶切酶或设计新的引物。
二、酶切位点结构性变化
酶切位点的周围结构性变化也可能导致双酶切失败。例如，DNA分子可能存在二级结构，如发生环状化、串联或配对等，这会导致酶无法正常切割。解决此问题的方法是使用特殊的酶切缓冲液或改变酶切反应条件，以使DNA分子解开二级结构。
三、酶切酶活性受抑制
酶切酶活性受抑制是双酶切失败的另一个常见原因。这可能是由于酶切缓冲液中存在抑制剂、酶切酶活性受到抑制剂的影响或酶切酶失活等原因造成的。解决此问题的方法是优化酶切反应条件，如调
整酶切缓冲液的配方、改变酶切反应的温度和时间等。
四、DNA样品质量差
DNA样品质量差也是导致双酶切失败的重要原因之一。DNA样品可能受到污染、降解、修饰或含有抑制物等，这会影响酶切酶的活性和DNA分子的可切割性。解决此问题的方法是提高DNA样品的纯度和完整性，如使用纯化试剂盒进行DNA提取、优化DNA提取方法或进行适当的DNA修复等。
五、反应条件不适宜
反应条件不适宜也是导致双酶切失败的原因之一。酶切反应的温度、时间、pH值、酶切酶的浓度等都会影响酶切反应的效果。解决此问题的方法是优化反应条件，如调整反应温度、延长反应时间、优化酶切酶的浓度等。
双酶切及连接
限制性内切酶的类型
第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的
识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固 定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是 特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。 因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型
第三类（Ⅱ型）限制性内切酶：就是通常指的ＤＮＡ限制性 内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能 在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推 动了分子生物学的兴旺和发展。
六、限制性内切酶酶切常见问题分析
问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
1.
1.
2. 3. 4.
标准底物检测酶活性
将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳 换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株 换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 将DNA底物与λDAN混匀进行切 割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证
双酶切
指导老师：陈思 组员：李婷 王鹏飞 高峰 姜威 邵振天
实验原理
• 用限制性内切酶去切割DNA片断，由于酶 具有专一性，一种酶只能识别一种特定的 脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种 酶去切割相应的DNA片断，进而达到定向 切割的目的。
三、仪器、材料与试剂
• • • • • • • • • • 水浴锅 移液枪和枪头 制冰机 浮板 PCR产物 SaⅡ酶 BgⅢ酶 10×H Buffer 无菌水 小离心管
思考题
影响限制性内切酶活性 的因素有哪些？
• • • • • • DNA的纯度 DNA的甲基化程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 溶液中离子浓度及种类 缓冲液的pH值
• 为什么任何时候2种酶 的总量不能超过反应 体系的1/10体积？
• 我们平时所用的酶试剂中 都含有一定量的甘油，用 量过多容易使酶产生星号 活性，即限制性酶的特异 性会受影响。
• 质粒DNA的双酶切 反应体系：
பைடு நூலகம்
BgⅢ
0.6μL
SaⅡ
10× Buffer PCR产物 无菌水 总体积
0.6μL
2μL 10μL 0.8 μL 20μL（无菌水补至总积）
反应条件：温度37℃，酶切h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
结果及分析
• 双酶切结果跑出一条 带，质粒无条带。 • 分析：质粒无条带， 可能是模板问题。 • 双酶切跑出一条带， 可能是酶切后DNA片 段太小，导致结果模 糊。
酶切注意事项及问题
酶切注意事项及问题
1、建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg 已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而
定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。
四、 DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至
双酶切连接反应之全攻略
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双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：/upload/2006/08/13/31219184.pdf。双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
酶切连接经验之谈
酶切
本实验室条件下酶切连接经验之谈
1、PCR产物可以切胶回收后酶切，用Elution buffer溶解即可，不影响后续实验。
2、50ulPCR产物切胶回收后用35ul Elution buffer溶解后只需取一半体积用于后续实验即可
满足要求。
3、PCR产物可以用乙醇沉淀法获得DNA用于后续反应，但需取少于一半的量用于后续实验，
否则会不能完全切开而导致实验失败。
4、双酶切时，若2种酶不是同一厂家时，可以根据Thermo厂家该2种酶的共同buffer，
选用Tango缓冲液，一般50ul体系各加1ul酶，而快切酶只需0.5ul,切3小时即可。
5、添加酶切试剂时，应先将buffer和样品振荡均匀后再加入相应的酶，轻弹混匀即可。
6、观察酶切后的载体片段会比质粒大很多，PCR产物双酶切后的片段也比未酶切时要大，
并且酶切后产物有时会呈现稍微弥散的宽带，由此可以判断是否切开。
7、部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。
大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。
而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：
（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；
（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点
双酶切：
1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切连接反应全攻略
双酶切连接反应全攻略
一、实验材料和试剂准备
1.DNA片段：需要连接的两个DNA片段，通常分别由PCR法或酶切法
获得。
2. 双酶切酶：选择两种具有互补端切位点的酶，如常用的 EcoRI 和HindIII。
3.T4DNA连接酶或其他适用的连接酶。
4.DNA连接试剂盒：如T4DNA连接试剂盒等。
5.反应缓冲液：根据连接酶选择合适的反应缓冲液。
二、双酶切连接反应步骤
1.酶切：将两个DNA片段用各自的切割酶酶切，生成互补的粘性末端。注意，切割反应需要在适当的反应缓冲液和温度下进行，在所选择的酶切
位点附近不得有其他酶切位点。
2.酶活化：将酶切后的DNA片段进行热变性处理，加入适当的酶活化
缓冲液，在65-80℃下进行5-10分钟的热处理，以去除酶切过程产生的
内切酶的限制性影响。
3.连接反应：将酶活化处理后的DNA片段加入连接反应体系中，加入
适量的连接酶和缓冲液，并在适当的温度下进行连接反应。连接反应温度
一般为16-20℃，反应时间根据试剂的不同而有所差异，一般为2-4小时
至过夜。
4.构建：将连接反应后的DNA取出，可根据需要进行进一步的DNA构建，如转化到宿主细胞中进行复制或进行其他分子生物学操作。
三、实验条件和注意事项
1.酶切反应：根据所选择的切割酶的活性要求选择合适的反应缓冲液
和酶切温度。
2.热变性处理：确保将酶切后的DNA片段充分变性，去除酶切产生的
限制性影响，但同时避免过度变性导致DNA不可恢复的损伤。
3.连接反应：根据所选择的连接酶和试剂盒的要求进行适当的缓冲液
和温度选择。
4.连接效率：连接效率可能受到多种因素的影响，如DNA片段的完整性、浓度、连接酶的活性和反应条件等。在实验过程中，可以调节影响连
酶切注意事项及问题
一、建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA.通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点.识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50％的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次.内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段.粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA”。
四、 DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染,以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容.
双酶切连接反应常见问题分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1. 回收PCR产物：
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
2. 纯化问题：
纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
3. 酶量的问题：
对1单位酶的定义如下：在50pl反应液中，30°C温度下反应1小时，将1pg的入DNA完全分解的酶量定义为1 个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15pg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3pg，而PCR纯化后的产物(50体系)约为3pg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC
R产物片段=1: 10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为pg单位的DNA：（X pmolesx长度bpx650）/ 1,000,000 （注：长度bpx650是该双链DNA的分子量）所得数值即为pg,也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66pg，如载体是5380b p,则0.03pmol 为0.03x5.38x0.66=0.106524pg。
双酶切连接反应
双酶切连接反应
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
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前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1. 回收PCR产物：
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
2. 纯化问题：
纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
3. 酶量的问题：
对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
5. 测DNA浓度：
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。
6. 连接反应：
TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
7.转化：
①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl
几个非常重要的问题：
1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。
3对照的设立：
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
做转化时，也要进行对照。
设4个：
①即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都'正常'的情况下。
②酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。
③设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
④AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。
4. 所有的试剂切记低温保存。注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。
同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内
切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。
如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。
使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。
双酶切建议缓冲液
注：
只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。
某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以"seq"标注。