微生物学实验
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总菌数 = （个/ml） X1 + X2 + X3 + X4 + X5 5 × 25（16） ×104×稀释倍 数
清洗血细胞计数板：用水冲净，后用吹风机吹干， 放入计数板盒中。 （切勿用硬物洗刷）
注意事项
1、取样前，必须将菌悬液摇匀。
2、计数室内不可有气泡。 3、凡压在中格线上的菌体，切莫四边全计， 常只计上方和右边两条线上的。 4、计数时，遇出芽的酵母菌，芽体大小达到母 细胞直径的一半时计为2个。
3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。
四、实验步骤
1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜和高倍镜寻找合适的视野并将 欲观察的部位其移到视野中央。 3 、加香柏油。 4 、转换油镜：将油镜转到工作位置，使油镜镜头浸入香柏油 中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。 5 、调节聚光器与油镜数值孔径一致 ： 将聚光器上升到最高 位置，可变光阑开到最大。 6 、调焦： 转动细调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像 清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜
乳酸石炭酸棉蓝染色优点：细胞不变形，不易干燥，防腐，保存时间较长，
三、实验器材
1、菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus） 红酵母（Rhodotorula SP） 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 黑曲霉（Aspergillus niger） 黑根霉（Rhizopus nigricans ） 总状毛霉（Mucor racemosds）
放线菌和真菌形态
放线菌
酵母菌
青霉菌
黑曲霉菌
根霉菌形态
根霉菌（无性孢子和有性孢子）
实验报告
绘细黄链霉菌、红酵母菌、产黄青霉菌 和黑曲霉菌的形态图。
实验四 微生物显微镜直接 计数法
一、实验目的
1、明确血细胞计数板计数的原理 2、掌握血细胞计数板进行微生物计数的方 法。
二、基本原理
小格 中格
镜检
清洁显微镜
2、芽孢染色
制片 染色 滴加孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片在微 火上加热至染液冒蒸汽时开始计时5min 加热过程中要及时添加染色液，切勿让标本干涸 水洗 待玻片冷却后，用缓流水冲洗至流出的水无 色为 止 复染 用番红染色液复染2min 水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出的水无色 镜检 干后用油镜观察
2、培养基：高氏1号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼 脂或查氏培养基。 3、试剂：0.1%美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、 50% 乙醇。 4 、器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接种 杯、解剖针、擦镜纸等。
四、实验步骤
放线菌形态观察方法（扦片法）
倒平板：冷至约50℃倒平板约20ml，凝固待用。 接种：用接种环挑取菌种在琼脂平板上划线接种。 扦片：用灭菌的镊子夹起盖玻片以约45℃扦入平板 内 （扦在接种线上） 培养：倒置平板，28℃培养5-7天。
2 、增加显微镜的分辨率
D值愈小则表明分辨力愈强。
D=0.61λ/NA
分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。
NA=n· sinα/2
λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值
n：介质折射率
α：镜口角（总是小于180°）
三、实验器材
1 、标本：细菌三型玻片。
2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。
计数时先计5个中方格（计5个点）的总菌数，然后求 得每个中方格的平均数，再乘以中格数（ 25或16 ）， 就得出一个大方格（ 0.1mm3 ）计数室中的总菌数， 再乘以104（换算成1mm 含菌量）及菌液的稀释倍数， 即可算出1mm 原菌液中的总菌数值。
总菌数 = （个/ml）
X1 + X 2 + X 3 + X 4 + X 5
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。 2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。 3 、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、 木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。
四、实验步骤
1 、革兰氏染色
涂片： 用接种环挑取少许菌苔于水滴中混匀后，再挑取2-3 环菌悬液至另一载片上涂开
干燥： 室温自然干燥或电吹风吹干 固定： 涂片朝上，通过火焰2-3次
初染：滴加草酸铵结晶紫覆盖涂片区域染色2min，水洗
染 色
媒染：滴加卢戈氏碘液，染色1min，水洗 脱色：用滴管加95%乙醇冲洗脱色约30秒，立即水洗 复染：滴加番红液复染约2min，水洗
酵母菌：单细胞真核生物
真 菌
形态：卵圆形、圆形、椭圆形或圆柱形等
繁殖方式：无性：主要为出芽繁殖，产生芽孢子
有性：产生子囊孢子
美篮染色优点：可区分死活细胞，活细胞能使蓝 色变无色，死细胞一直呈蓝色。
霉菌：霉菌可产生复杂分枝的菌丝体（基内菌丝和气生菌丝），
气生菌丝长到一定阶段分化产生分生孢子梗，分生孢子梗上 产生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形态特征是分类的重 要依据。 繁殖方式：主要产生无性孢子和产生有性孢子繁殖
霉菌形态观察方法（直接制片法）
载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液。 从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝。 置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子。 放到载玻片的染液中，用解剖针将菌丝分散开。 盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
Hale Waihona Puke 注意事项1、镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生 菌丝的粗细和色泽差异。 2、染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时， 染液过多会溢出，过少会出现大量气泡而影响观 察。 3、制片时，用镊子或解剖针小心将菌丝分开， 要尽可能保持霉菌自然生长状态和完整性。
实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察
一、实验目的 1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。 2、观察和识别细菌的三种基本形态。
二、基本原理
1 、增加照明强度
在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的 镜油，使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失， 基本上全进入镜头，结果提高了照明强度，使图像更 加清晰。 折射率(n) 空气 1.00 水 1.33 香柏油 1.52 玻璃 1.55
5
×25 （或16 ） ×104×稀释倍数
三、实验器材
1、菌种：红酵母菌（Rhodotorala sP）。 2、试剂：无菌生理盐水。 3、器具：显微镜、血细胞计数板、吹风机、盖 玻片、无菌滴瓶（内装玻璃珠）、无菌毛细管、 擦镜纸、吸水纸等。
四、实验步骤
菌悬液制备：以计数室内每小格5-10酵母菌为宜。 清洗计数板：自来水冲洗计数板后用吹风机吹干。 加菌液：用毛细管吸取酵母菌悬液滴加在盖玻片边 缘，让菌液沿缝隙自动进入计数室。 显微镜计数：每个计数室选5个中格（4个角各1个 和中央1个）计数。 计算
实验报告
1、绘枯草芽孢杆菌芽孢染色图
2、将革氏染色结果填于下表
菌种 大肠埃希氏菌 枯草芽孢杆菌 菌体颜色 菌体形态（图示） G+或G-
实验三 放线菌和真菌的形态 特征观察
一、实验目的
1、学习观察放线菌和真菌形态的基本方法。 2、观察放线菌和真菌的形态特征。
二、基本原理 放线菌：放线菌是无隔分枝的菌丝体，为革兰
常用的测定微生物数量方法有镜检直接计数法和平板菌 落计数法。镜检直接计数法采用血细胞计数板。构造如下：
平面图
1mm2共分400小格 厚1mm，可得总数
盖玻片
侧面图 计数室 计数室全貌
方格网，分为9个大格，中央大格E为计数室
放大的计数室，分25中格
放大的中格，分16小格
二、基本原理
计数室大方格的边长为1mm，则每一个大方格 的面积为1mm2，计数室与盖玻片高度为 0.1mm，计数室体积为0.1mm3（万分之一毫升）。
氏阳性菌。 典型放线菌的菌丝体分化产生各种形 态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体
气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、各种螺旋或轮生）等，是分类鉴定的重要依据 孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子
扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，
使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻 片上。观察时，轻轻取出盖玻片，可观察到不同生长时期放线菌自 然生长状态下的形态特征。
棒状杆菌
螺旋菌
注意事项
1 、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切
忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从 侧面注视。 2 、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反 方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。
实验报告
1、绘细菌三种基本形态图
2、简述油镜的工作原理
实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法
实验报告
1、将结果填入下表
中格菌数 计数室 X1 第一室 X2 X3 X4 X5 中格菌数 （平均值） 大格总菌数 稀释倍数 菌数/个· mL
-1
第二室
实验五 显微测微尺的使用和 微生物大小的测定
一、实验目的
1 、学习并掌握用显微测微尺测定微生物大小的原理 和方法。 2 、增强微生物细胞大小的感性认识。
一、实验目的
1 、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的 原理和方法。 2 、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分 类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理 革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法， 通过这种染色方法，可将细菌分为两大类： 一类被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌； 一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。 其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和 结构不同。
染色结果（革兰氏染色）
枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）
大肠杆菌（革兰氏染色）
染色结果（革兰氏染色）
金黄色葡萄球菌（革兰氏染色）
染色结果（芽孢染色）
枯草芽孢杆菌（芽孢染色）
注意事项
1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会 造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。 2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为 宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性 菌转呈阴性反应。 3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在 菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37℃下培养12-14h效果 最佳。 4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂 片干涸。
1 盖玻片 2 培养基
镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一 面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面 朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载玻片中 镜检。
酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）
载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液。
挑取酵母菌苔少许，置美蓝染色液中混合均匀。 用镊子取盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢 将盖玻片放下，以免产生气泡影响观察。 用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。 反之， G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖 层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜 迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与 碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄 等红色染料复染, 就使G-细菌呈现红色, 而G+细菌则保 留紫色。
染色结果：阳性细菌（G+）： 染成紫色 染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
清洗血细胞计数板：用水冲净，后用吹风机吹干， 放入计数板盒中。 （切勿用硬物洗刷）
注意事项
1、取样前，必须将菌悬液摇匀。
2、计数室内不可有气泡。 3、凡压在中格线上的菌体，切莫四边全计， 常只计上方和右边两条线上的。 4、计数时，遇出芽的酵母菌，芽体大小达到母 细胞直径的一半时计为2个。
3 、器具：显微镜（有油镜）、擦镜纸、玻璃棒等。
四、实验步骤
1 、放置标本:将染色的细菌三型玻片置于镜台上。 2 、找合适的视野: 先用低倍镜和高倍镜寻找合适的视野并将 欲观察的部位其移到视野中央。 3 、加香柏油。 4 、转换油镜：将油镜转到工作位置，使油镜镜头浸入香柏油 中。注意油镜镜头千万不要压在玻片标本上。 5 、调节聚光器与油镜数值孔径一致 ： 将聚光器上升到最高 位置，可变光阑开到最大。 6 、调焦： 转动细调焦螺旋，再缓慢地提升油镜调焦至物像 清晰。注意下降或上升镜筒或载物台绝不可用力过猛。 7 、观察: 仔细观察细菌的三种基本形态 8 、显微镜用毕后的处理: 上升镜筒，取下玻片，清洁油镜
乳酸石炭酸棉蓝染色优点：细胞不变形，不易干燥，防腐，保存时间较长，
三、实验器材
1、菌种：细黄链霉（Streptomyces microflavus） 红酵母（Rhodotorula SP） 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 黑曲霉（Aspergillus niger） 黑根霉（Rhizopus nigricans ） 总状毛霉（Mucor racemosds）
放线菌和真菌形态
放线菌
酵母菌
青霉菌
黑曲霉菌
根霉菌形态
根霉菌（无性孢子和有性孢子）
实验报告
绘细黄链霉菌、红酵母菌、产黄青霉菌 和黑曲霉菌的形态图。
实验四 微生物显微镜直接 计数法
一、实验目的
1、明确血细胞计数板计数的原理 2、掌握血细胞计数板进行微生物计数的方 法。
二、基本原理
小格 中格
镜检
清洁显微镜
2、芽孢染色
制片 染色 滴加孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片在微 火上加热至染液冒蒸汽时开始计时5min 加热过程中要及时添加染色液，切勿让标本干涸 水洗 待玻片冷却后，用缓流水冲洗至流出的水无 色为 止 复染 用番红染色液复染2min 水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出的水无色 镜检 干后用油镜观察
2、培养基：高氏1号琼脂、麦芽汁琼脂、马铃薯葡萄糖琼 脂或查氏培养基。 3、试剂：0.1%美蓝染液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、 50% 乙醇。 4 、器具：显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、接种 杯、解剖针、擦镜纸等。
四、实验步骤
放线菌形态观察方法（扦片法）
倒平板：冷至约50℃倒平板约20ml，凝固待用。 接种：用接种环挑取菌种在琼脂平板上划线接种。 扦片：用灭菌的镊子夹起盖玻片以约45℃扦入平板 内 （扦在接种线上） 培养：倒置平板，28℃培养5-7天。
2 、增加显微镜的分辨率
D值愈小则表明分辨力愈强。
D=0.61λ/NA
分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离的能力。
NA=n· sinα/2
λ：光波波长 NA：物镜的数值孔径值
n：介质折射率
α：镜口角（总是小于180°）
三、实验器材
1 、标本：细菌三型玻片。
2 、试剂：香柏油、镜头清洗液（V乙醚:V酒精＝7:3）。
计数时先计5个中方格（计5个点）的总菌数，然后求 得每个中方格的平均数，再乘以中格数（ 25或16 ）， 就得出一个大方格（ 0.1mm3 ）计数室中的总菌数， 再乘以104（换算成1mm 含菌量）及菌液的稀释倍数， 即可算出1mm 原菌液中的总菌数值。
总菌数 = （个/ml）
X1 + X 2 + X 3 + X 4 + X 5
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。 2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。 3 、器具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、 木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸等。
四、实验步骤
1 、革兰氏染色
涂片： 用接种环挑取少许菌苔于水滴中混匀后，再挑取2-3 环菌悬液至另一载片上涂开
干燥： 室温自然干燥或电吹风吹干 固定： 涂片朝上，通过火焰2-3次
初染：滴加草酸铵结晶紫覆盖涂片区域染色2min，水洗
染 色
媒染：滴加卢戈氏碘液，染色1min，水洗 脱色：用滴管加95%乙醇冲洗脱色约30秒，立即水洗 复染：滴加番红液复染约2min，水洗
酵母菌：单细胞真核生物
真 菌
形态：卵圆形、圆形、椭圆形或圆柱形等
繁殖方式：无性：主要为出芽繁殖，产生芽孢子
有性：产生子囊孢子
美篮染色优点：可区分死活细胞，活细胞能使蓝 色变无色，死细胞一直呈蓝色。
霉菌：霉菌可产生复杂分枝的菌丝体（基内菌丝和气生菌丝），
气生菌丝长到一定阶段分化产生分生孢子梗，分生孢子梗上 产生生孢子。分生孢子梗和分生孢子的形态特征是分类的重 要依据。 繁殖方式：主要产生无性孢子和产生有性孢子繁殖
霉菌形态观察方法（直接制片法）
载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液。 从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝。 置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子。 放到载玻片的染液中，用解剖针将菌丝分散开。 盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
Hale Waihona Puke 注意事项1、镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生 菌丝的粗细和色泽差异。 2、染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖片时， 染液过多会溢出，过少会出现大量气泡而影响观 察。 3、制片时，用镊子或解剖针小心将菌丝分开， 要尽可能保持霉菌自然生长状态和完整性。
实验一 显微镜（油镜）的使用和细菌 的三种基本形态观察
一、实验目的 1、学习并掌握油镜的基本原理和使用方法。 2、观察和识别细菌的三种基本形态。
二、基本原理
1 、增加照明强度
在油镜与载玻片之间加入与玻片的折射率相仿的 镜油，使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失， 基本上全进入镜头，结果提高了照明强度，使图像更 加清晰。 折射率(n) 空气 1.00 水 1.33 香柏油 1.52 玻璃 1.55
5
×25 （或16 ） ×104×稀释倍数
三、实验器材
1、菌种：红酵母菌（Rhodotorala sP）。 2、试剂：无菌生理盐水。 3、器具：显微镜、血细胞计数板、吹风机、盖 玻片、无菌滴瓶（内装玻璃珠）、无菌毛细管、 擦镜纸、吸水纸等。
四、实验步骤
菌悬液制备：以计数室内每小格5-10酵母菌为宜。 清洗计数板：自来水冲洗计数板后用吹风机吹干。 加菌液：用毛细管吸取酵母菌悬液滴加在盖玻片边 缘，让菌液沿缝隙自动进入计数室。 显微镜计数：每个计数室选5个中格（4个角各1个 和中央1个）计数。 计算
实验报告
1、绘枯草芽孢杆菌芽孢染色图
2、将革氏染色结果填于下表
菌种 大肠埃希氏菌 枯草芽孢杆菌 菌体颜色 菌体形态（图示） G+或G-
实验三 放线菌和真菌的形态 特征观察
一、实验目的
1、学习观察放线菌和真菌形态的基本方法。 2、观察放线菌和真菌的形态特征。
二、基本原理 放线菌：放线菌是无隔分枝的菌丝体，为革兰
常用的测定微生物数量方法有镜检直接计数法和平板菌 落计数法。镜检直接计数法采用血细胞计数板。构造如下：
平面图
1mm2共分400小格 厚1mm，可得总数
盖玻片
侧面图 计数室 计数室全貌
方格网，分为9个大格，中央大格E为计数室
放大的计数室，分25中格
放大的中格，分16小格
二、基本原理
计数室大方格的边长为1mm，则每一个大方格 的面积为1mm2，计数室与盖玻片高度为 0.1mm，计数室体积为0.1mm3（万分之一毫升）。
氏阳性菌。 典型放线菌的菌丝体分化产生各种形 态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体
气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、各种螺旋或轮生）等，是分类鉴定的重要依据 孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子
扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片后培养，
使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻 片上。观察时，轻轻取出盖玻片，可观察到不同生长时期放线菌自 然生长状态下的形态特征。
棒状杆菌
螺旋菌
注意事项
1 、油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切
忌用眼 睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从 侧面注视。 2 、调焦时，应特别注意，切勿将粗调节器向反 方向(由高向低)转动而损失镜头和玻片。
实验报告
1、绘细菌三种基本形态图
2、简述油镜的工作原理
实验二 细菌的芽孢染色和 革兰氏染色法
实验报告
1、将结果填入下表
中格菌数 计数室 X1 第一室 X2 X3 X4 X5 中格菌数 （平均值） 大格总菌数 稀释倍数 菌数/个· mL
-1
第二室
实验五 显微测微尺的使用和 微生物大小的测定
一、实验目的
1 、学习并掌握用显微测微尺测定微生物大小的原理 和方法。 2 、增强微生物细胞大小的感性认识。
一、实验目的
1 、学习并掌握革兰氏染色和芽孢染色的 原理和方法。 2 、了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分 类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理 革兰氏染色法是Gram发明的一种细菌鉴别染色法， 通过这种染色方法，可将细菌分为两大类： 一类被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌； 一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。 其染色原理主要根据两类细菌的细胞壁化学组成和 结构不同。
染色结果（革兰氏染色）
枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）
大肠杆菌（革兰氏染色）
染色结果（革兰氏染色）
金黄色葡萄球菌（革兰氏染色）
染色结果（芽孢染色）
枯草芽孢杆菌（芽孢染色）
注意事项
1、革兰氏染色关键是脱色时间，如脱色时间过长，会 造成假阴性。如脱色时间过短，会造成假阳性。 2、革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为 宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性 菌转呈阴性反应。 3、芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在 菌体内为宜。芽孢杆菌一般在37℃下培养12-14h效果 最佳。 4、在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂 片干涸。
1 盖玻片 2 培养基
镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一 面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面 朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载玻片中 镜检。
酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）
载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液。
挑取酵母菌苔少许，置美蓝染色液中混合均匀。 用镊子取盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢 将盖玻片放下，以免产生气泡影响观察。 用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况。
二、基本原理
1 、革兰氏染色原理
通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可 形成不溶于水的结晶紫液和碘液的复合物，G+细菌由于 其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联致密，因此遇脱 色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含 类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与 碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。 反之， G-细菌的细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖 层薄，交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜 迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与 碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。再经番红、沙黄 等红色染料复染, 就使G-细菌呈现红色, 而G+细菌则保 留紫色。
染色结果：阳性细菌（G+）： 染成紫色 染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。