尿苷菌种选育及发酵条件优化

尿苷是重要的合成药物的中间体，可以修复导致疾病的破损基因，提高机体抗体水平，促进和改善脑细胞代谢，可以阻断各种癌细胞和病毒复制时的基因合成，并被用于制造氟尿嘧啶、脱氧核苷、碘苷、溴苷、氟苷等特效生物药物[1]。国际上，日本有两家公司供应发酵法生产的尿苷产品，但其供应的产品数量较少，且售价偏高。国内仅上海太平洋生物高科技公司一家曾采用RNA水解法生产尿苷，由于工艺落后，成本高，现已停产。预计国内市场年需求量约30吨，国际市场150吨，而世界目前年产量还不足50吨，所以发酵法生产尿苷市场前景看好，出口创汇可观。

传统的嘧啶核苷的生产方法是使用核糖核酸(RNA)经化学方法水解，然后制备两种嘧啶核苷，这不仅需要大量的优质RNA原料，而且两种嘌呤核苷(腺苷和鸟苷)及两种嘧啶核苷(胞苷和尿苷)都必须平衡产销，否则成本价会很高。而发酵法则是借助于微生物，通过诱变扩大其合成核苷的能力，从而能够大规模地单一地根据市场需求生产尿苷，降低此类药物的生产成本。20世纪80年代至90年代中期，日本科学家开始发表发酵法生产尿苷的成果，而国内尚无这方面研究成果报导；本文主要研究了尿苷生产菌株的诱变选育及摇瓶发酵条件优化。

1材料与方法

1．1菌种

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)TJ374，由天津科技大学应用微生物实验室提供。

1．2培养基

基本培养基[2](g／L)：葡萄糖5、柠檬酸钠1、(NH4)2SO42、KH2PO46、K2HPO414、MgSO40．2、琼脂20。

完全培养基(g／L)：葡萄糖5、蛋白胨10、酵母粉5、牛肉膏10、NaCl2．5、琼脂20。

种子培养基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨10、酵母膏10、玉米浆10ml、MgSO40．5、KH2PO40．5。

发酵培养基[2][3]：葡萄糖140、尿素20、玉米蛋白粉7、玉米浆30(g/L)ml、豆浓5ml、CaC120．5、MgSO40．5、KH2PO40．5、CaCO35。

1．3诱变筛选方法

1．3．1菌悬液的制备

新鲜斜面菌种接种于肉汤摇瓶，34℃培养8h~10h，以10％的接种量转接于肉汤摇瓶，34℃培养至对数生长前期，离心收集细胞；磷酸缓冲液(pH7．0)洗涤三次；用装有玻璃珠的三角瓶振荡30min分散细胞后，稀释成108个／ml的菌悬液。

1.3．2UV诱变育种

按参考资料[4]略作改进。

1．3．3DES、UV复合诱变育种

取20ml菌悬液用1％DES30℃、160rpm处理30min离心、洗涤、适当稀释后进行UV诱变。1．3．4筛选方法

经诱变处理过的菌悬液，适当稀释后，根据所

尿苷菌种选育及发酵条件优化

程远超刘康乐黄艳辉徐庆阳陈宁

（天津科技大学生物工程学院，天津300222）

摘要：以野生型枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)TJ374为出发菌株，根据代控制发酵原理，采用DES (硫酸二乙酯)及UV(紫外)诱变处理，定向选育出一株尿苷产生菌Tc142(2TU r+6AU r％UP-)，在培养基未经优化的情况下产尿苷2．3~2．4g/L。同时，考察了培养基对菌株产苷的影响，在优化的培养基中发酵积累尿苷3.4g／L，最高可产尿苷3.6g/L。

关键词：枯草芽孢杆菌尿苷菌种选育发酵

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要求得到的不同突变株，分别作不同的处理。长出菌落后再经过点接不同培养基平板对比检出所需要的突变株。

1．4培养方法

种子培养：取斜面34℃活化24h 的新鲜菌种，接入种子培养基36℃、170rpm 培养8h~10h 。

发酵培养：取种子菌液按10％接种量接入发酵培养基，37℃、210rpm 培养72h 。

1．5测定方法

采用高效液相(HPLC)方法测定发酵液中尿苷产量：色谱柱：5C18~150A ，4．6mm ×150mm ，流动相：4％乙腈+96％纯净水，柱温：30℃，流速：0．5ml ／

min 。吸收波长：262nm 。

2结果

2．1尿苷产生菌的选育谱系

以野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

TJ374为出发菌株，经硫酸二乙酯和UV 诱变处理，选育U -(尿嘧啶缺陷)菌株，然后依次赋予2TU r (2—硫尿嘧啶抗性)和6AU r (6—氮尿嘧啶抗性)及UP -(尿苷磷酸化酶缺失)遗传标记[1]，得到一株尿苷

产生菌Tc142，在适宜的条件下摇瓶产酸平均为

2．3g ．L -1~2．4g ．L -1．选育过程见图1

2．2发酵培养基的优化

优化发酵培养基是为了使菌体能最大限度的合成目的产物，发酵培养基的好坏直接影响到菌体的生长状态及目的产物的合成。发酵培养基与种子培养基不同，它不仅提供菌体生长繁殖所需的营养和能源，而且也提供构成尿苷的物质来源，要积累大量的尿苷，就要有适量的碳源和氮源配比，而且无机盐及生长因子也是必须考虑的影响因素[5]。

2.2．1不同碳源、氮源对Tcl42合成尿苷的影响

碳源是供应微生物碳元素的营养物质，是构

成菌体细胞的重要材料，主要用于合成菌体的糖类、脂肪以及次级代谢产物，是微生物生命活动能量来源和物质基础[5]。作者考察了在发酵培养基中分别加入不同碳源对菌体产苷的影响(添加质量浓度为120g ．L -1)，结果见图2．氮源是合成菌体蛋白质、核酸、酶及各种初级和次级代谢产物等含氮物质，在尿苷的生物合成中；它是合成嘧啶环的主要来源之一，在发酵生产中选用合适的氮源很重要[5，6]。为此作者考察了在发酵培养基中分别添加不同氮源(含氮量以硫酸铵40g.L -1小的用量的含氮量来计算其它氮源的添加量)对Tc142合成尿苷的影响，结果见图3．

图2表明，葡萄糖和蔗糖对Tcl42合成尿苷效果都很好，但由于用蔗糖发酵，发酵过程中雄糖的测定较为复杂，所以选择葡萄糖作为碳源更为合适。图3表明，不同氮源对合成尿苷影响很大，从产苷角度看，尿素最好，硫酸铵其次，其它的氮源菌体难以利用，因此选择尿素为氮源。

图2不同碳源对尿苷发酵的影响

图3不同氮源对尿苷发酵的影响

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