ABI Solid Sequencing
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
高通量测序技术
的玻璃表面(即Flow cell)，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。
然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS(边合成边测序)技术对待测的模板DNA进行测序。
ABI SOLiD连接法测序(sequence by ligation)技术应用测序技术推进科学研究的发展。
随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。
比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing)，获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种，进行全基因组重测序(resequencing)，在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。
在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing)，从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing)，通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。
在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。
这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。
目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。
科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。
NGS测序技术与分析流程图
数据格式示例
• Fastq 格式
• Color Space 格式
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Phred score
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质量控制
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利用galaxy进行原始数据处理
https:///
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Galaxy History ' VGN FASTQ'
https:///u/jjv5/h/unnamed-history-1
Ion torrent
Ion Torrent 测序原理
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精度
• Examples:
• • 90% confidence (10% error rate) =
Q10
• • 99% confidence (1% error rate) =
Q20
• • 99.9% confidence (.1% error rate) =
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测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100 多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系 统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
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454 Pyrosequencing
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454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是 噬菌体X174的，全长5375个碱基
精品课件
• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基， 其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用 来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入 一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显 影后可以根据电泳带的位置精品确课件定待测分子的DNA序列
3大二代测序平台的优缺点
一、ABI的solid liiumina的SOLEX 和ROCHE/454的GX FLX，三种平台在技术特点上有什么异同？面对三种平台，该如何选择呢？简而言之：Roche 454是焦磷酸测序；Illunima Solexa是合成法测序；ABI SOLiD是连接法测序。
就读长来看：Roche 454 > Illunima Solexa > ABI SOLiD。
就Reads数来看：ABI SOLiD > Illunima Solexa > Roche 454。
就应用来看：Roche 454读长最长，便于拼接，因此在de novo测序方面有很大优势；ABI SOLiD虽然读长很短，但是Reads数最多，而且ABI独有的双色球编码技术，使得每个碱基都会被读取两遍，准确率很高，因此ABI SOLiD在检测SNP、转录组测序、ChIP-Seq等方面很有优势；Illunima Solexa的读长和Reads数均位于中间，比较适合于基因组重测序。
而在实际应用中，由于Roche 454成本太高，因此Illunima Solexa 也被较多的应用于de novo测序。
二、关于生物芯片和二代测序1：现在二代测序很火，有一种取代芯片的趋势，我想知道，生物芯片和二代测序各自的优缺点？2：什么样的研究，使用芯片更好?什么样的测序更好？3：关于不同的测序平台，测的长度不同，有什么样区别？4：什么是数字表达谱？microarray和NGS都是高通量的基因组学研究手段，两者还是有较显著的差异。
首先，根本机制不同，Microarray本质上是核酸杂交；NGS本质上是PCR。
其次，microarray是一个封闭的系统，不可能检测到探针没有覆盖到的那部分信息；而NGS是一个开放的系统，来什么，测什么。
（1）microarray不能发现新序列，而NGS可以发现一些以前没有检测到的基因。
（2）由于NGS本质上还是PCR，在建库的过程中样本被扩增上千倍，因此样本中基因的量的线性关系会有所偏差。
新一代测序技术solid
新一代测序技术（下）-SOLiD (ABI)摘要：2005年454公司首推划时代的新一代测序仪，从而引发了测序市场上454、Illumina、ABI等公司在新一代测序技术上的比拼高潮。
也正是这种你追我赶，让绘制人类全基因组图谱由过去的耗费亿美元和13年时间，骤然缩短到如今SOLiD 3运行一次即获得50GB可定位测序数据。
生物通6月重磅推出新一代测序技术专题，将逐个为你解析Illumina、ABI、Roche（454）的新一代测序仪，并汇集世界各大基因组中心诸多牛人对新一代测序仪的选择标准及使用反馈。
敬请期待！过去20年，美国应用生物系统公司（ABI）在测序方面一直占据着垄断地位。
自公司的共同创始人Leroy Hood在上世纪80年代中期设计了第一台自动荧光测序仪之后，生命科学研究就摆脱了手工测序的繁琐和辛劳，骄傲地迈入自动测序的新时代。
直到2005年，454推出了FLX焦磷酸测序平台，ABI的领先地位开始有些动摇。
之后，ABI迅速收购了一家测序公司——Agencourt Personal Genomics，并在2007年底推出了SOLiD 新一代测序平台。
从SOLiD 到如今的SOLiD 3，短短一年多时间，它已经上演了一出精彩的“一级方程式赛车”。
SOLiD全称为supported oligo ligation detetion，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。
就通量而言，SOLiD 3系统是革命性的，目前SOLiD 3单次运行可产生50GB 的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。
而其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。
为什么SOLiD能轻松实现貌似不可能的任务？让生物通带你从测序原理入手，一探究竟。
SOLiD工作流程SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragment library)或配对末端文库(mate-paired library)。
ABI与Illumina测序仪比较
ABI与Illumina、454测序仪比较Illumina 测序仪Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Illumina公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa，就是为了促成Genome Analyzer的商品化。
Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
Genome Analyzer自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。
今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。
而就在前两周，《Nature》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。
它们全是依赖Genome Analyzer完成的。
哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。
根据去年底的数据，Genome Analyzer已售出约200台，估计是市场占有率最广的。
前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer。
而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad研究院拥有47台Illumina测序仪。
众多实验室之所以选择Illumina，看中的无疑是Genome Analyzer的高性价比。
上个月，Illumina将Genome Analyzer II升级到Genome Analyzer IIx，距年底实现单次运行获得95 GB数据的宏伟目标又近了一步。
Genome Analyzer IIx有两个核心特征：其一是更大的试剂冷却器，支持超过100个测序循环，进一步提升了系统的易用性和自动化；其二是全新的流动池支架，让每轮运行所得的高质量数据增加20%。
第二代测序技术
SO、油包水PCR
SOLiD流程
3、含DNA模板P1磁珠的固定
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
5. 数据分析原理
Polonator
测序原理： Polonator系统高质量测序是一种以连接 反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用 结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板， 以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧 光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续 的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行 大规模高通量测序。
第二代高通量测序技术简介
四大高通量测序平台
Solexa，454 (GS-FLX)，
SOLiD和P测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation)
454 (GS-FLX)
Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
Polonator流程
SOLiD
ABI(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 原理 ：用连接法测序获得基于“双碱基编 码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的 数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色 编码的reference序列，把SOLiD颜色序 列定位到reference上，同时校正测序错 误，并可结合原始颜色序列的质量信息发 现潜在SNP位点。
第二代测序技术
SO、油包水PCR
SOLiD流程
3、含DNA模板P1磁珠的固定
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
SOLiD流程
5. 数据分析原理
Polonator
第二代高通量测序技术简介
四大高通量测序平台
Solexa，454 (GS-FLX)，
SOLiD和Polonator
测序原理
合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(
Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
至300-800bp间，经末端修复与特异性接头 连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。
454 (GS-FLX)流程
包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里进 行独立的扩增，回收纯化；
454 (GS-FLX)流程
3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入 PTP板中供测序反应使用。
454 (GS-FLX)流程
4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行 当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿 个碱基信息
Solexa-Illumina Genome Analyzer
测序原理： Polonator系统高质量测序是一种以连接 反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用 结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板， 以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧 光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续 的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行 大规模高通量测序。
SOLiD 产品介绍(ABI 新一代高通量基因分析系统)
P1
P2
Beads with no product Beads with amplified product (~40K PCR products per bead)
4) Template disassociates
18
Date | AB CONFIDENTIAL
© 2007 Applied Biosystems
emulsion PCR Individual Bead
P1-coupled beads
1) Template Anneals to P1
2) Polymerase extends from P1
5
Date | AB CONFIDENTIAL
© 2007 Applied Brected resequencing)
Forward
1µm bead
Reverse DNA Fragment 60-90 Bases Adapter
Next Gen
Message: AB’s SOLiD™ System is better than 454 & Solexa
Next Next Generation
Invest in internal & External R&D programs Message: Still many years away AB has heavy internal & external investments
© 2007 Appliednscriptome (RNA)
● MicroRNA Discovery
● Directed Resequencing (PCR Products)
一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用
备注：数据来源于罗氏官网和网络
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
ABI/SOLiD技术原理： SOLiD测序技术也是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多， 只有1μm大小，用连接酶替代了常用的DNA聚合酶。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
① Ion Torrent测序芯片，是一块半导体芯片； ② 孔即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。 ③ 4种dNTP依次流过Ion芯片； ④ 发生聚合反应产生H+引起PH变化，被传感器记录下来。 每个碱基的检测只需要几秒钟。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
读长
2x150bp 2x150bp 2x300bp
台式测序 2x150bp
台式测序/大规 模
2x150bp
大规模 测序
2x250bp
大规模 测序
2x150bp
测序通量 1.2Gb 7.5Gb
15Gb
120Gb
330Gb
6000Gb
16Tb
最大reads数 4M
25M
25M+
运行时间 9.5-19h 4-24h
4-55h
400M 12-30h
1.1B+ 11-48h
200亿 13-44h
260亿（单） 520亿（双）
13-48h
二代测序的技术平台——华大智造
华大基因先推出了BGISEQ-500桌面化测序系统， 之后又推出： BGISEQ-50、 MGISEQ-200、 MGISEQ-2000均取得了NMPA（原CFDA）认证， 还推出了MGISEQ-T7， 2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、DNBSEQ-T7高通量测 序仪。
基因检测的应用现状及发展研究报告
基因检测的应用现状及开展研究一，概述〔基因检测行业〕1.基因检测简介基因：是遗传的物质根底，是DNA〔脱氧核糖核酸〕分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
基因检测：指通过基因芯片等方法对被测者细胞中的DNA分子进展检测，并分析被检测者所含致病基因、疾病易感性基因等情况的一种技术。
基因检测目前基因检测主要是利用SNP芯片进展检测，然后比照数据库进展易感基因分析，然后进展相关分析出具报告。
基因检测是人在没发病时，预测将来会发生什么疾病，即是主动预防疾病的发生。
基因体检主要目的有四个:一用于疾病的诊断；例如白血病的诊断分类等，都需要进展相关的基因检测;二是疾病的预防，就是检测安康人群的基因型，预测个人患病的风险，并向受检者提出生活上的指导，防止疾病的发生。
基因体检可以对疾病做到：早知道、早预防、早调整、早治疗。
三是了解自己的基因特征，指通过检查您的基因来发现您现有的和潜在的个人特性;第四个人用药平安说明，在就医时，主动对医生出示您的个性用药说明书，并根据您个人的遗传信息，合理用药，提升药效，防止药物危害。
二．基因检测的在临床应用环境分析2.1基因检测的历史，产业构造。
目前位置基因检测技术归功于NGS的进步，并且主要的应用还是在上游产业， NGS的开展。
自2005年454公司首先推出了二代测序仪;2006年，Sole*a 推出了Genome Analyzer，2007年Illumina收购Sole*a公司，在随后的几年陆续推出了Hiseq2000、MiSeq、Hiseq2500、MiseqD*、Ne*tSeq 500测序仪，成为主流的测序平台。
ABI也在2007年推出的是SOLiD测序平台，随后收购了454测序仪创造者创立的Ion Torrent，转而大力推广PGM和Ion Proton平台，Pacific Biosciences的PacBio RS测序仪，DNA模板无需二代测序常用的PCR 扩增的方法，就可以实现长读长、实时的测序;O*ford Nanopore MinION测序仪只有USB存储器则大等等至今是NGS第十年，illumina公司的Hiseq *平台已经实现了1000美金一个人类基因组测序的目标。
深度测序技术简介
Brain
118 162 85 73 91 48 266 217 91 10
0 46 41 0 8 0 240 51 716 132
UHR
861 163 35
0 96 0 271 1538 0 10 113 799 12 42 346 59 81 0 0 69
Symbol Gene Description
SNV： Single Nucleotide Substitution Variant
DIGITAL EXPRESSION PROFILING（1）： 人大脑组织与UHR（UNIVERSAL HUMAN REFERENCE）的表达差异
Tag Sequence GATCAAACCAAGGCCCAGGC GATCACTGTTAATGATTTGC GATCAGTGTCTTTTCAGCAC GATCATCATGACCAATGAAA GATCATGCTGGCTGCAAAGA GATCCAAACCCAAGTCTTGA GATCCAAGATAAAGAAGGCA GATCCCAGACTGGTTCTTGA GATCCCCAATTGACTCAGAG GATCCGGGGCTGCAGGCTTG GATCCTACAGAAGTGGAGCT GATCCTAGTAATTGCCTAGA GATCCTGCGGGAGTCTCCCG GATCCTGTGAAGGCCTGGAA GATCGAGACACGTGATGGGA GATCGAGGACAGTGCAACCA GATCTCAATGCCAATCCTCC GATCTGCACGCCGCTGACCC GATCTGTGCCCAGAGATGGG GATCTGTGGAGAATGTACAC
UBB Ubiquitin B RING1 Ring finger protein 1 DIRAS2 DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2 PHF20 PHD finger protein 20
abisolid测序原理
abisolid测序原理Abisolid测序原理是一种高通量测序技术，它基于大规模并行的DNA合成和测序原理，可以同时进行上千万个DNA单元的测序。
该技术利用DNA合成和连接方法来生成大量的小碎片序列，并在其中添加标识序列，随后通过基于荧光信号的测序反应来查询这些碎片的序列信息。
这种技术已经广泛应用于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等领域。
Abisolid测序的具体步骤包括：首先将初始DNA样品剪切成随机长度的小片段，然后将这些片段分别与标识序列进行连接，形成带有唯一序列标记的DNA文库。
接着用荧光标记的核苷酸反应与单个DNA分子上的碱基相互作用，将它们转换成荧光信号。
这个过程被称为“链终止法”，因为每次添加的核苷酸都会阻止进一步的DNA合成。
每个反应后，这个过程就被暂停下来，并且会记录下来该碱基的颜色，完成此步骤后可扫描图片记录下荧光信息以及对应的位置。
荧光信号颜色与不同的碱基标志相连，便可以得到DNA序列。
Abisolid测序技术的优点是可大规模进行文库构建和并行化DNA测序。
相对于传统的Sanger测序，它具有更高的测序速率和更深的覆盖率，因为在同一时间内，能够同时处理大量的DNA文库。
Abisolid测序能够提供数十亿个DNA序列信息，使得高通量的基因组学研究成为可能。
与传统的测序方法相比，Abisolid测序还具有更低的错误率和更低的成本，能够为基因组分析提供更精确的数据。
总之，Abisolid测序技术的应用领域广泛，包括基因级SNP分析、复杂表型研究、进化分析以及人类遗传疾病的研究等领域。
随着测序技术和相关的数据分析方法的不断进步和创新，Abisolid测序技术必将为基因组学领域的发展和突破注入新的活力。
测序技术介绍
该测序技术的具体做法如下：将模板、引物、4 种 dNTP（其中含有一种为放射性同位素标记的核苷酸） 与DNA 聚合酶共同保温，形成的混合物包含许多长短 不一的片段， 最后利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 （SDS-PAGE）分离该混合物，得到放射性同位素自显 影条带图谱，人们依据凝胶电泳图即可读出DNA 双链 的碱基序列组成。
• 主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一 段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强 度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。
第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G）， 如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。
测序过程中的常见问题分析
6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象? 下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含
2 项技术的出现，标志第1 代测序技术诞生。
Sanger 测序法的原理
每一次DNA 测序反应都由4 个独立反应组成； 由于DNA 双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测序
过程中掺入2′，3′-双脱氧核苷三磷酸———ddNTP（不含3′-OH）， 当ddNTP 位于DNA 双链的延伸末端时， 无羟基3′端不能与其他 脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键， 因此，DNA 双链合成便终 止；
3：测序结果和文献资料不一样，为什么?原因有很多，如同一种动物，在不同 的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR 产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客 户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致。
常用的五种基因测序仪器的比较
桥式PCR
2. Illumina GA的特性
2. HeliScope 的优势
• 单分子测序减少了试剂的使用，测序成本 价格大大降低，使得人的基因组测序低于 1000美元慢慢走向可能。
• 不需要扩增建立DNA库，从而切断数据结 果中潜在错误的来源
五种测序仪器的比较
• 由上表可以看出，第二代和第三代测序仪由于消耗的试剂 少在测序费用上有了明显的降低，但是在读长上3730xl依 然具有绝对的优势，不过随着技术的完善，新一代的测序 仪依然拥有极大的提升空间。
2. ABI 3730xl特性
• 通过几十年的逐步改进, ABI 3730xl测序仪的读长 可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达 99.999%测定每千碱基序列的成本是 0.5 美元, 每 天的数据通量可以达到 600 000 碱基
• 但是ABI 3730xl测序技术在速度和成本方面都已达 到了极限. 由于其对电泳分离技术的依赖,使其难以 进一步提升分析的速度,并且难以通过微型化降低 测序成本. 尽管如此, ABI 3730xl的方法可靠、准确, 且已形成规模化, 特别是在 PCR 产物测序、质粒 和细菌人工染色体的末端测序、以及STR基因分型 方面,将继续发挥重要作用.
乳液PCR扩增 焦磷酸测序
2. ROCH-454的优势
• 454平台的突出优势是读长。目前454系统 的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的 测序成本比其他平台要高很多，不过对于 那些需要长读长的应用，如从头拼接和环 境微生物组学，它仍是最理想的选择。
NGS测序
Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。和焦磷酸测序不同，每次DNA的只能延伸一个核苷酸。Solexa的读长在100-150bp之间，适合小RNA鉴定、甲基化和表观遗传学研究。
高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。
454公司首选将焦磷酸测序应用在测序技术上，之后便被罗氏诊断收购，形成了目前的Roche 454。待测DNA样品被打断成300-800bp的片段后，3' 和5'端分别加上接头，这些接头会使DNA片段结合到微珠上。测序PCR反应就发生在固相的微珠上，并且整个PCR反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含1个DNA模板。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。454测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到DNA测序的目的。相对于Sanger测序，Solexa和Solid测序而言，454可以提供中等的读长和适中的价格，适合de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。
第二代测序的法医学运用
第二代测序技术及其法医学运用基因组DNA 碱基序列差异是不同个体间最本质的遗传差异，对碱基序列的测定，人们一直在努力探索。
到目前为止测序技术经历了三代发展。
第一代测序技术以Sanger双脱氧核苷酸链终止法和Maxim降解法为代表，但由于Sanger 双脱氧核苷酸链终止法比Maxim 化学降解法需要更少的有毒化学药品，放射性同位素标记[1]，因此它成为了DNA 测序常用的技术，而且其测序准确性高，被认为是确定基因序列的金标准。
第一代测序技术，因其操作简单，读长长，而被广泛运用。
但第一代测序无法实现一次大样本测序，而且耗时长，成本高。
以高通量、低成本为主要特点的第二代测序技术应运而生。
二代测序技术（又称下一代测序技术，next gen eratio n seque ncin g ,NGS主要包括Roche公司的454测序技术、lllumine公司的Solexa测序技术和ABI公司的SOLID测序技术。
二代测序技术比起一代测序技术在测序通量、成本、时间等方面都有突破。
二代测序技术最主要的特点就是通量高，一次能对多个样本同时测序，但是二代测序技术因其高通量的同时会带来相对短的读长，这是二代测序技术发展面临的主要问题。
第三代测序技术（又称为next-next-generation sequencing是以单分子测序为主要特征，而不经过前期文库的构建、PCR 扩增目的基因片段，使测序更为精确。
目前对DNA 单分子直接测序的第三代测序技术还在研究。
第二代测序技术操作简单、通量高、成本低，仍是目前应用较为广泛的技术。
本文就二代测序技术及其法医学运用做简要介绍。
1 第二代测序技术Roche公司的454测序技术，利用焦磷酸测序的原理，通过DNA延伸时产生的焦磷酸盐来确定碱基顺序。
即如果加入的未标记的dNTP 与模板链互补，在DNA聚合酶的作用下产生等摩尔的焦磷酸盐（ppi），焦磷酸盐在硫酸化酶、荧光素酶的作用下转变成荧光，根据加入的dNTP 的类型和荧光信号的强度，可以确定模板DNA 核苷酸的序列。
solid 测序原理
solid 测序原理Solid测序技术是一种基于塞夫理论（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection）的第二代测序技术，它的原理是先将DNA片段通过连接器链接到固相载体上，然后再通过引物扩增和连接器切除的方式进行测序，利用碱基识别酶的不同，来判断碱基序列并加以记录。
该技术具有高灵敏度、高准确度、高通量的优点，因此在基因组、转录组和表观基因组等领域的研究中被广泛应用。
Solid测序技术具体的测序原理如下:1. 序列文库构建首先，需要提取待测序的DNA样品，并将其在酸性条件下进行片段化。
随后，将片段化后的DNA通过连接器链接到固相载体（bead）上，形成独立的固相小球文库。
2. 序列扩增在完成固相小球文库构建后，可以进行PCR扩增，引物在PCR反应中同时负责将连接器的两端连接到一起，在PCR反应过程中产生多个水平的引物结合。
此过程中，引物结合于小球文库并引发多次扩增，形成的DNA树状结构可由连接器操作指令整理出。
因此，该技术可以进行若干次循环扩增。
3. 碱基串接通过将碱基与家蚕酶配对，熔解连接器的方法，可为下一步构建碱基链打下基础。
碱基链与连接器关联形成链式草图并形成数据流。
连接器仅在草图的外围保留，已识别的碱基可以识别出接下来的碱基，并进行追踪和记录，最后完成该小球文库的测序。
4. 数据分析最终，需要对测序数据进行整理和分析，该技术所生成的SEQ文件包含了所有根据样品而确定的碱基信息。
在数据分析中，可以对测序数据进行比对、组装、注释和筛选，与不同物种的基因组进行对照分析，以确定DNA序列中存在的准确汉字碱基数量。
还可以进行基因组结构分析、遗传变异、表达水平分析和单细胞RNA测序等方面的研究。
总之，Solid测序技术是一种高效而有效的基因组测序技术，它能够针对较长的DNA序列进行高通量和准确的测序，为生物学的发展和基因组学的研究提供了强有力的工具。
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ABI SOLid SequencingSolid技术Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。
它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序。
它的原理是：图a. Solid测序技术1.DNA文库构建片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
2.Emulsion PCRSolid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。
在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。
3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图a）。
Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
3.连接酶测序这一步是Solid测序的独特之处。
它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。
Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。
连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图a）。
这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。
这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。
这种测序方法也称之为两碱基测序法。
当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图a和图b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。
在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。
不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。
即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。
接着用引物n-1进行第二轮测序。
引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图a. 8）。
也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。
该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。
由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。
但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
图b. Solid测序技术新一代测序技术-SOLiD (ABI) SOLiD工作流程a. 文库制备SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragment library)或配对末端文库(mate-paired library)。
使用哪一种文库取决于你的应用及需要的信息。
片段文库就是将基因组DNA 打断，两头加上接头，制成文库。
如果你想要做转录组测序、RNA定量、miRNA探索、重测序、3’, 5’-RACE、甲基化分析、ChIP测序等，就可以用它。
如果你的应用是全基因组测序、SNP分析、结构重排/拷贝数，则需要用配对末端文库。
配对末端文库是将基因组DNA 打断后，与中间接头连接，再环化，然后用EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。
b. 乳液PCR/微珠富集在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（Emulsion PCR）。
PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。
微珠上的模板经过3’修饰，可以与玻片共价结合。
看到这里，是不是有一种似曾相识的感觉呢？那就对了，此步骤与454的GS FLX基本相同。
不过SOLiD系统的微珠要小得多，只有1 um。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。
其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。
这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。
理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。
c. 微珠沉积3’修饰的微珠沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。
SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
d. 连接测序这一步可就是SOLiD的独门秘笈了。
它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶。
SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。
连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。
探针3’端1～5位为随机碱基，可以是ATCG四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3～5位的“n”表示随机碱基，6～8位的“z”指的是可以和任何碱基配对的特殊碱基。
单向SOLiD测序包括五轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应。
第一轮测序的第一次连接反应由连接引物“n”介导，由于每个磁珠只含有均质单链DNA模板，所以这次连接反应掺入一种8碱基荧光探针，SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息，随后的化学处理断裂探针3’端第5、6位碱基间的化学键，并除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5’磷酸，为下一次连接反应作准备。
因为第一次连接反应使合成链多了5个碱基，所以第二次连接反应得到模板上第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息……几个循环之后，引物重置，开始第二轮的测序。
由于第二轮连接引物n-1比第一轮错开一位，所以第二轮得到以0，1位起始的若干碱基对的颜色信息。
五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位... …的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。
e. 数据分析SOLiD测序完成后，获得了由颜色编码组成的SOLiD原始序列。
理论上来说，按照“双碱基编码矩阵”，只要知道所测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解码”成碱基序列。
但由于双碱基编码规则中双碱基与颜色信息的简并特性（一种颜色对应4种碱基对），前面碱基的颜色编码直接影响紧跟其后碱基的解码，所以一个错误颜色编码就会引起“连锁解码错误”，改变错误颜色编码之后的所有碱基。
和其它所有测序仪一样，测序错误在所难免，关键是对测序错误的评价和后续处理。
由于SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，提供内在的校对功能。
这样，双保险确保了SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。
为避免“连锁解码错误”的发生，SOLiD数据分析软件不直接将SOLiD原始颜色序列解码成碱基序列，而是依靠reference序列进行后续数据分析。
SOLiD序列分析软件首先根据“双碱基编码矩阵”把reference碱基序列转换成颜色编码序列，然后与SOLiD原始颜色序列进行比较，来获得SOLiD原始颜色序列在reference的位置，及两者的匹配性信息。
Reference 转换而成的颜色编码序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有两种情况：“单颜色不匹配”和“两连续颜色不匹配”。
由于每个碱基都被独立地检测两次，且SNP位点将改变连续的两个颜色编码，所以一般情况下SOLiD将单颜色不匹配处理成测序错误，这样一来，SOLiD分析软件就完成了该测序错误的自动校正；而连续两颜色不匹配也可能是连续的两次测序错误，SOLiD分析软件将综合考虑该位置颜色序列的一致性及质量值来判断该位点是否为SNP。
系统可扩展性SOLiD系统采用开放玻片式的结构，使用包被DNA样品的微珠来输入基因组信息。
微珠密度并不是一成不变的，系统支持更高密度的微珠富集。
开放式玻片形式、微珠富集、以及软件算法的结合，能使平台轻松升级到更高的通量，而无需对基础技术和配置做重大改变。
这也是SOLiD系统平均每季度将通量扩大一倍的原因所在。
无以伦比的通量目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的17倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的。
今年初，ABI公司和贝勒医学院人类基因组测序中心（HGSC）的科学家总结了他们在千人基因组计划首次数据发布中的贡献。
作为商业参与者以及与HGSC共同协作，ABI公司利用SOLiD系统产生了超过460 GB可作图的序列数据，比这两个机构的预定目标高出了65%。
而通量的升高也有望进一步降低基因组测序的费用，成本只需1万美元的人类基因组测序指日可待。
最大的灵活性SOLiD 3系统具有两个独立的流动室，让用户能在一台SOLiD分析仪中运行两个完全独立的实验——同时提供两套仪器。
玻片也能分成1个、4个或8个小室。
而20个条形码序列则提供了额外的灵活性，显著增加了定向重测序、表达和ChIP分析的经济性。
目前最多能同时运行320个样品（2×8×20）。
至此，SOLiD系统已不再是一台单纯的测序仪，而是成为功能更全面的基因分析仪。
除了测序和重测序，还能进行全基因表达图谱分析、SNP、microRNA、ChIP、甲基化等多种分析。
全基因表达图谱分析芯片大概是目前应用最广泛的从全局角度分析基因表达整体模式的方法。
然而，基于杂交技术的微阵列技术只限用于已知序列，无法检测新的mRNA；而且杂交技术灵敏度有限，难以检测低丰度的目标（需要更多的样品量），难以检测重复序列；也无法捕捉到目的基因表达水平的微小变化------而这恰恰是研究在刺激下或环境变化时的生物反应所必需的。
与芯片技术相比，基于测序的高灵敏SOLiD技术可对单个细胞和癌症样品中存在的痕量RNA进行整体的全基因组表达图谱分析，每次运行能定位高达2亿4千万个标签（mRNA 的相对表达水平可通过系统产生的序列标签数目来计算），可检测低至每个细胞中10-40pg 的总RNA，即使mRNA表达水平很低，SOLiD系统也能够无偏向性地分析样品中存在的已知和未知mRNA，从而定量特定mRNA的差异表达模式。