提取外周血淋巴细胞
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。
下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。
- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。
- 为实验准备足够数量的外周血样本。
2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。
- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。
3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。
- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。
4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。
5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。
- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。
- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。
6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。
- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。
- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。
请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。
在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。
同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。
希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
PBMC提取
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。
其中淋巴细胞占很大一部分。
分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
注意事项全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。
否则将分层混乱。
步骤：配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。
然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。
离心完毕将得到如图所示分层；PBMC所在细胞层为白色。
此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。
e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。
外周血细胞分离的方法有几种
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。
其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。
此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。
血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。
下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。
其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。
此法分离的细胞纯度也不高。
氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。
淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。
另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。
提取淋巴细胞流程
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。
但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。
[1]关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。
此方法取材方便，用血量少，操作简便。
1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。
在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。
所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。
有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。
“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。
[3]淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。
因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。
各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体无法进行的研究。
本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
详细的淋巴细胞的分离计数图文教程
注意事项
稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
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细胞计数的仪器
血细胞分析仪，临床常用
装有自动显微镜观察系改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
用Hank’s液洗、离 心 (1000rpm，5min) 重复2次
血浆
分层液 红细胞 粒细胞
淋巴细胞与单 核细胞层
用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞 计数液或台盼兰计数液混合
取10ul于细胞计数板上
细胞计数
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本实验：淋巴细胞
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实验方案
抽取外周血 分离淋巴细胞 细胞计数
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实验材料
1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液 4. 水平离心机 5. 显微镜 6. 细胞计数板
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实验步骤
肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5mlHank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
实验结果
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×10 (稀释倍数）
2
细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色）
活细胞百分率 =
活细胞数
细胞总数
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× 100%
密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
qPCR 样本处理(1)--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
人外周血淋巴细胞RNA的提取方法一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
取1.5ml 无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血t淋巴细胞提取
人外周血T淋巴细胞提取是指从人体外周血样本中分离并纯
化T淋巴细胞的过程。
T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有调节免疫应答和击杀感染性病原体等功能。
通过对外周血中
T细胞的提取，可以进一步研究其功能和特性，并在免疫治疗、细胞治疗等领域应用。
人外周血T淋巴细胞提取的具体步骤包括：
1. 采集外周血样本：使用采血针或血管穿刺等方法从患者或捐赠者的外周血中取得样本。
2. 血液分离：采用离心等方法将血液分离为红细胞、白细胞和血浆等不同组分。
3. 白细胞富集：采用离心梯度离心或负选择等技术将白细胞富集到一定程度。
4. CD3阳性细胞筛选：使用单克隆抗体等与CD3表面分子结合，利用磁珠或荧光标记等方法对T细胞进行筛选，获得
CD3阳性的T细胞群体。
5. 细胞纯化：通过进一步的磁珠或荧光标记等技术，对T细
胞进行纯化，去除其他污染细胞，得到较纯的T细胞群体。
在人外周血T淋巴细胞提取的过程中，需要严格的操作和消
毒措施以确保样本的无菌和安全性。
此外，细胞提取后的T
细胞可以进一步用于细胞培养、分化、鉴定等实验操作，用于研究和治疗目的。
ELISPOT
ELISPOT检测HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)是否有候选肽特异性的T淋巴细胞，候选肽能否将它激活。
用ELISPOT检测活化T细胞分泌的IFN-r证实在正常人PBMC中是否有NY-BR-1特异性的CTL存在，同时也反应了各肽的免疫原性。
ELISPOT和51Cr杀伤实验检测表位肽的免疫原性结果显示HLA-A2阳性健康人外周血中有候选肽MLLQQNVDV(167～175)和NMWLQQQLV(1274～1282)特异性的前体细胞。
1．什么是ELISPOT检测?答:酶联免疫斑点( enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT) 检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。
淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原或刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISPOT培养板中。
这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISPOT培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。
将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。
然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。
最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（SPOT）。
每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。
实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图象分析仪（BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析。
该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况。
第二部分：关于ELISPOT试验技术中对细胞的处理1．提取外周血淋巴细胞时，有那些注意事项？答：如果取外周血淋巴细胞(PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。
在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。
PBMC 细胞分类与不同细胞比例
20ml血液大约提取9.6-13.6 X 106 PBMC
PBMC（外周血单个核细胞）包括淋巴细胞（T、B、NK）、单核细胞和树突状细胞。
在人体中这些细胞的比例因人而异。
在多数研究中，淋巴细胞约占PBMC的70～90％，单核细胞约为10～30％，树突状细胞非常少，约为1～2％。
对其中占多数的淋巴细胞进一步细分，可发现其中70～85％为CD3＋T细胞（折算成PBMC 的比例约45～70％），5～20％为B细胞（折算成PBMC的比例约15％），5～20％为NK细胞（折算成PBMC的比例约15％）。
CD3＋T细胞由CD4＋T细胞（约占PBMC25～60％）和CD8＋T细胞（约占PBMC 5～30％），比例约2：1。
CD4＋和CD8＋T细胞均可进一步分为初始T（naive T）、接触过抗原的中心记忆性、效应记忆性和效应性T细胞。
对于这些亚群，由于不同研究使用的标记不同，故比例亦相差较大。
CD4＋T细胞又称为辅助性T细胞，可按照细胞因子表达的不同而继续分为不同的功能亚群，包括调节性T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9、滤泡辅助性T、TR1等亚群。
这些亚群的区分只会越来越复杂。
CD8＋细胞毒性T细胞现在可大致分为200个功能表型。
循环B细胞包括过渡型、未致敏、记忆型以及浆母细胞，各个亚群比例不一。
循环树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞和髓系来源树突状细胞。
循环单核细胞可分为经典型单核细胞和非经典型CD16＋促炎症反应单核细胞（约占单核的10％）。
人类免疫系统功能研究极其依赖PBMC的表型和功能评估，因此对外周血各类亚群表型和功能、PBMC与组织免疫细胞的不同进行充分了解是非常必要的。
淋巴细胞培养与分离
抗CD3磁球 磁球
2．羰基铁粉吞噬法
原理： 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的 能力， 能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞 密度增大。 密度增大。 方法一： 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密 度梯度离心后， 度梯度离心后，则单核细胞沉积于 管底而被去除 而被去除。 管底而被去除。 方法二： 磁铁将细胞吸至管底 将细胞吸至管底， 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上 层液中即含较纯的淋巴细胞。 层液中即含较纯的淋巴细胞。
(三)单核细胞和粒细胞的去除
1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子 存在条件下能主动粘附在玻璃 塑料、 玻璃、 存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、 尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。 尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集 的非粘附细胞即为淋巴细胞。 的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点： 细胞也有较弱的粘附能力， 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有 部分B细胞丢失。 部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95% 95%的单个核细 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细 胞为淋巴细胞，活性大于95% 95%。 胞为淋巴细胞，活性大于95%。
（3）流式细胞术
• 又叫荧光激活细胞分离仪 (nuorescence sorter, activated cell sorter, FACS )法 原理： 原理： 细胞经荧光染色 荧光染色后 通过高速流动 细胞经荧光染色后，通过高速流动 单行， 系统，细胞排成单行 系统，细胞排成单行，逐个流经检测区 进行测定。 进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出 超声振荡动液流， 时，超声振荡动液流，使液流断裂成一 连串的均匀小滴(4000 /s)， (4000个 连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内 最多含一个细胞， 最多含一个细胞，细胞经激光束照射产 生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分 转换成脉冲信号，数据经电脑处理， 辨细胞的类型。 辨细胞的类型。
人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm×20分钟。
3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
淋巴细胞分离与培养
• （2）培养空间 • 培养液与液面上的空间二者的体积比例 一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好 维持在2～5mm 的范围,以便于气体交 换。 • （3）恒温培养箱 • 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
• 5、常见失败原因 • (1) 污染 • 污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括 细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。 支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响 较小,尤其只培养72 小时。一般是分离 过程中的用液和培养基出现了污染。
• EB病毒可有效地转化外周血B淋巴细胞, 建立永生的淋巴母细胞系,可永久保存宝 贵的病例材料。世界上许多遗传研究中 心都用此方法处理每一份血标本，在液 氮中冻存转化后的淋巴细胞。这样就可 以无限期地保存、复苏和增殖病人体细 胞样本，建立人类遗传种质库
• 淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B 细胞有天然的亲和力并可使其发生转化 并增殖。与通常在体外使用的B细胞活化 剂引起的B细胞的暂时的一过性分裂不同， EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细 胞：病毒感染后不能在细胞体内复制后 代，但能整合在宿主细胞基因组上，一 部分整合了病毒基因组的细胞发生转化
• （2）血样本的采集：先以碘酒和75%乙 醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素 • （3）接种：常规消毒后，立即将针头插入 灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁 将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养 瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾 斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以 混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温 箱内静置培养72h。
• 2、方法 • (1)．采静脉血2ml 加入肝素抗凝管 • (2)．用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用 玻璃棒），2000rPm 离心20 分钟，用毛 细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中， 于4℃冰箱保存备用，
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。
对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。
每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。
本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。
但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要：在正常情况下，人外周血淋巴细胞是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，源出于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA的这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞便可得到所需要的人体染色体图形。
本实验具有用血量少，操作简单等优点[1]。
关键词：外周血淋巴细胞染色体秋水仙素双抗前言：通过本实验掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。
人外周血中的小淋巴细胞几乎都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。
当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
细胞遗传学组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：(1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用。
PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
(2）秋水仙素的应用。
秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
(3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察[2]。
1设备和药品1.1设备低温冷冻离心机；离心管；精密pH试纸；恒温培养箱；恒温水浴锅；棉花；毛细管；玻璃棒；烧杯；载玻片；培养瓶；采血针；冰柜1.2药品RPMI“1640”粉末；NaHCO3粉末；肝素；秋水仙素；植物凝血素（PHA）；青霉素；链霉素；姬姆萨粉末；0.1mol/L磷酸缓冲液；生理盐水；KCl低渗液；蒸馏水；纯甘油；甲醇；酒精2方法2.1药品制备2.1.1 RPMI“1640”培养基：是一种综合培养基，称取“1640”粉末1.05g,用100mL的蒸馏水溶解，如溶液出现浑浊或难以溶解时，可用干冰或CO2处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。
实验一外周血淋巴细胞的分离
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能 长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养 获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从 脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合 成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能 在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的 平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬 液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤 细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞
鸡外周血淋巴细胞的分离和体外培养
2011 年第33 卷第11 期China Poultry Vol．33No．11．2011 研究简报鸡外周血淋巴细胞的分离和体外培养谢昆，蒋成砚，全舒舟，王冉（红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661100 ）本试验探索了不同密度淋巴细胞分离液对鸡ConA，100 ml/L 的胎牛血清，100 μg/mL 青霉素和外周血淋巴细胞的分离效果，以及ConA 不同的浓100 μg/mL 链霉素的RPMI-1640 液悬浮，取一滴度和培养时间对鸡淋巴细胞的成活率的影响，研究细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×106 个/mL。
结果为禽类淋巴细胞的分离及细胞因子的诱导培1.4 鸡外周血淋巴细胞的培养养研究奠定基础。
将稀释至5×106 个/mL 的细胞悬液，分装于1 材料与方法细胞培养瓶中， 5 CO2 培养箱中25 ℃分别培1.1 材料养8、12 、18 、24 h 后，取1 滴细胞悬液0.4 台盼蓝鸡购买于蒙自农贸市场。
取颈部静脉血液染色计数淋巴细胞活率。
20 mL 左右置于预先加入500 μL 肝素钠溶液 2 结果（10 mg/mL ?┑奈蘧 胄墓苤校 ≡缺赣谩?2.1 不同密度淋巴细胞分离液对鸡外周血淋巴1.2 试剂细胞的分离效果人淋巴细胞分离液（密度：1.077 ）购自上海恒通过比较密度分别为1.077 、1.085 、1.092 的淋信化学试剂公司；泛影葡糖胺购自蒙自县医院；刀巴细胞分离液的分离结果，发现 3 个密度的分离豆蛋白 A （ConA ）购自Sigma 公司；改良型液分层都明显，1.085 g/mL 的淋巴细胞分离液白RPMI-1640 购自赛默飞世尔生物化学制品（北膜层稍厚，1.092 g/mL 其次，1.077 g/mL 较薄。
京）有限公司；肝素钠购自国药集团化学试剂有限1.085 g/mL 淋巴细胞分离液可有效分离出鸡外周公司；优质新生牛血清购自中美合资兰州民海生血淋巴细胞（见表1）。
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/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞
分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。
现在大多数用的密度梯度离心法。
一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。
现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
我的经验
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分
温度20c －28c
时间：20分钟
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)
5。
取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。
还有办法的。
8 离心。
转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)
时间：10分钟
温度：4c
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
10.细胞计数＋洗涤细胞。
刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。
这样是不是很节省时间？？
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
总共数4大正方形
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。
加入rIL-2 25－50u/孔后，放入培养箱.
看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！
1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是
2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的
3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团
建议;
不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。
所以第一步离心的转速也会有所不同。
最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
我用的是eppendorf离心机，上海xx所的淋巴细胞分离液（名字忘记了）效果比较好。
不推荐使用北京夏斯的细胞分离液，连个说明书都没有，而且分离得到的细胞中，血小板会很多.
非常感谢主任的建议，但是小弟这样做证明
利用离心是可以把细胞与分离液体分开的。
我也培养结核杆菌，它门就是漂浮在培养液的上面，膜状生长，但是我通过离心，就能把细菌集结到管底，当然这就需要很高的转速和较长的时间。
实践证明我这样做是有用的。
还有个明显的证明就是，你把第一步离心的速度加大试试看，到2500以上，可能所有的pbmc 都会沉到分离液的下面。
至于吸取血浆，我是这样考虑的：少吸取一点，不要为了吸取血浆把层次搞乱了。
这样吸血浆内就不会混有pbmc。
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zhengsg2000战友您好，淋巴细胞分离做的多了，也积累了一点经验和教训，谈谈我的想法。
我不明白您为什么要PBS稀释，我觉得没必要。
肝素抗凝后可以直接分离。
还有，您分离中我发现是标本多分离液少，我觉得正好反了，淋巴细胞分离最好标本量≤分离液的量。
2000r离心时间10分钟足够了，dongwp战友说的很对，如果吸出过多分离液，相对要多加PBS，混匀后二次离心，其实没有必要吸那么多分离液，离心后，中间层可见明显的灰白色的淋巴细胞层，只把它吸出来就可以了。
淋巴细胞分离的方法操作并不是那么严格，每个人的操作条件可能不一样，达到目的就可以了。
这种分离方法，不可能把单核细胞和淋巴细胞分离开的。