鄂柑一号椪柑少核芽变的AFLP分析

鄂柑一号椪柑少核芽变的AFLP分析摘要:利用AFLP技术,对鄂柑一号椪柑(Citrus reticulata Blanc. cv. ponkan)的3个少核芽变及其母株进行分子鉴定｡筛选了64对引物,有60对引物可扩增出清晰的条带,共获得2 281条清晰的扩增谱带,其中有9对引物可扩增出明显多态性条带,多态性位点共15个,占总数的0.66%｡结果表明,鄂柑一号椪柑的少核芽变由遗传物质改变引起,通过AFLP技术可以有效鉴定｡关键词:椪柑(Citrus reticulata Blanc. cv. ponkan);芽变;AFLPIdentification of Three Few-seed Mutant from E-Gan No.1 by AFLPAbstract: Three few-seed bud mutations and their mother plant ‘E-Gan No.1’ ponkan were identificated by AFLP technique. 64 selective primer combinations were tested and 2 281 clear bands were abtained from 60-pair-primer, from which 9-pair-primer were selected for further reseach. And 15 polymorphic bands were dectected out of 2281 total clear bands; the polymorphic rate was 0.66%. This results indicated that there were some molecular level differentiation between E-gan No.1 and the three few-seed bud mutations; and the differentiation could be identificated by AFLP.Key words: bud sport; Citrus reticulata Blanc. cv. ponkan; AFLP鄂柑一号是湖北省农业科学院果树茶叶研究所从椪柑实生苗中选出的新品种[1],是椪柑中的一个优良的鲜食品种,具风味浓厚､抗寒性强及耐贮藏等优点,但果实种子偏多｡进行鄂柑一号的少核育种研究可以提高其经济效益｡近年来我们发现了鄂柑一号的3个少核芽变,其所结果实的种子明显少于母株果实,经过几年高接试验,其少核性状比较稳定｡但是否为遗传物质芽变引起,仍然不能肯定｡近年来发展起来的RAPD､AFLP､ISSR､MSAP等分子标记技术可以在芽变早期快速鉴定遗传物质是否发生改变[2-5]｡在这些分子标记技术中,AFLP不仅具备其他分子标记的优点,而且在操作过程中用样量少､灵敏度高,且带纹丰富,对于鉴定多态性低的芽变较为适合｡试验以鄂柑一号的3个少核芽变为材料,利用AFLP技术分析芽变材料及其母株,旨在早期从分子水平鉴定鄂柑一号的少核芽变,缩短育种周期,提高鄂柑一号少核芽变的选种效率｡1材料与方法1.1试验材料供试材料来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所柑橘资源圃｡鄂柑一号及其3个少核芽变:金优-I､金优-II､金优-III,3个少核芽变于2006年高接在成年温州蜜柑树上,树体健壮,正常田间管理｡试验随机采取供试树体外围的幼嫩叶片,每株进行3次重复,液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用｡1.2DNA提取DNA提取采用改进的CTAB法[6]｡DNA的纯化按照TaKaRa公司的纯化试剂盒说明进行,琼脂糖凝胶电泳检测DNA｡1.3AFLP分析引物及接头序列参照V os等[7]的AFLP技术体系,由上海生物工程技术服务有限公司合成,具体见表1,其中E和M分别表示EcoRⅠ引物和MseⅠ引物｡酶切反应体系20 μL,采用EcoRⅠ引物和MseⅠ两种内切酶,DNA 250 ng, EcoRⅠ(10 U/μL) 0.3 μL,MseⅠ0.3 μL, 10×Buffer 2.0 μL,加灭菌去离子水至20 μL,置于37 ℃水浴3 h ,65 ℃温浴2.5 h,同时进行接头复性,酶切后的DNA采用T4 DNALigase连接,加入20 μL连接混合液:4.0 μL连接缓冲液,加灭菌去离子水至20 μL,混匀后25 ℃放置2 h｡连接好的产物稀释10倍后取5 μL作为预扩增反应的模板,加入MseⅠ引物(50 ng/μL) 1 μL,EcoRⅠ引物(50 ng/μL)1 μL,2×Taq MasterMix(北京博迈德科发展有限公司) 10 μL,去离子水 3 μL｡按如下程序扩增30个循环:94 ℃､30 s;56 ℃､30 s;72 ℃､80 s｡将扩增产物稀释50倍后取5 μL作选择性扩增反应的模板,加入MseⅠ引物(50 ng/μL)1.2 μL,EcoRⅠ引物(50 ng/μL) 0.4 μL,2×Taq MasterMix(北京博迈德科发展有限公司)10 μL,去离子水3.4 μL｡第一轮扩增程序:94 ℃､30 s;65 ℃､30 s;72 ℃､80 s;以后每轮循环温度递减0.7 ℃,扩增12个循环;第三轮23个循环:94 ℃､30 s;55 ℃､30 s;72 ℃､80 s｡扩增产物各加入10 μL Loading Buff er混匀,95 ℃变性,冰浴备用｡取10 μL 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 2 h,银染分析｡1.4相似性分析对获得的DNA谱带进行数字化统计,有带的位置计为1,无带的位置计为0,将统计结果输入Excel 表格中,利用NTSYSpc 2.1数据分析软件进行聚类分析,相似性系数采用Dice系数,相似性系数计算公式为:Sij=2Nij / (Ni+Nj),其中Sij为材料i 和j的相似系数,Nij是材料i和j共有的条带数,Ni和Nj分别是i和j各自的条带数｡2结果与分析2.1DNA提取质量采用改进的CTAB法提取各材料的基因组DNA,图1为DNA质量检测结果,D260/D280均在1.8~2.0,RNA去除干净,电泳谱带均无拖尾,说明所提DNA质量较高,可用于后续试验｡2.2引物筛选结果试验共筛选了64对引物,其中有60对可扩增出清晰条带,大多数引物在芽变枝与普通枝间的扩增产物完全相同,只有9对引物扩增出了明显的多态性条带,分别是EAA/MCAG､EAG/MCAC､ETA/MCAA､ETA/MCAC､ETT/MCAA､ETT/MCTC ､ETT/MCTA､ETT/MCAC､EAT/MCAC｡每对引物扩增位点变化区域在23~55 bp,平均每对引物可扩增出38条可以清晰统计的条带,各引物组合扩增的条带数见表2,可以扩增出多态性位点的引物组合见表3｡2.3AFLP差异分析在鄂柑一号与金优-I､金优-II､金优-III的引物筛选中,有9对引物可扩增出具有明显多态性的谱带,多态性位点共15个,占总条带数的0.66%｡金优-I与鄂柑一号差异位点有12处,多态性比例为0.53%(图2､图3､图4中箭头所指),金优-II与鄂柑一号差异位点有6处,多态性比例0.26%(图2､图3中箭头所指),金优-III与鄂柑一号差异位点有5处,多态性比例0.22%(图2､图3中箭头所指)｡3个芽变类型与亲本品种之间存在不同程度的遗传差异,每个芽变多态性带数与亲本品种带数的比例反映了不同的芽变程度｡推测金优-I的遗传芽变最大,金优-II次之,金优-III的最小｡2.4鄂柑一号与少核芽变的相似性分析根据引物扩增的有效多态性条带,计算它们之间的相似系数,其中金优-I与鄂柑一号的相似系数为0.997 4,金优-II与鄂柑一号的相似系数为0.998 7,金优-III与鄂柑一号的相似系数为0.998 9｡分析结果表明,对于鄂柑一号,金优-II､金优-III发生的芽变程度要低于金优-I｡3讨论柑橘少核或无核果实既受树种品种内在遗传因素的影响,也受外在因素的刺激｡雄性不育主要是指花粉败育,绝大部分的少核无核柑橘品种都与花粉败育有关;胚囊的异常发育也是导致少核无核的原因之一,华盛顿脐橙､温州蜜柑等除与花粉不育有关,还与胚囊的不育密切相关;自交不亲和是那些具有单性结实能力的树种或品种产生少核无核的又一原因,克可迈丁橘是有名的自交不亲和品种,以其作亲本的杂种后代也常出现自交不亲和类型;胚中途败育等原因也可导致少核无核果实｡此外一些外界因素,如花粉刺激､温度刺激､激素诱导等在一定条件下也可以导致少核无核果实｡果树中现有的少核无核品种大多来自于有核品种的芽变或珠心胚实生芽变｡芽变选种较其他育种方式有着独特的优势,但由于饰变因素的存在,需要对果树芽变进行早期鉴定｡鉴定芽变的方法主要有形态学观察,同工酶分析,染色体倍性､数量与结构芽变检测以及分子标记技术｡由于发生芽变的品种之间亲缘关系很近,遗传差异非常小,所以选择合适有效的鉴定方法非常重要｡一些研究者在鉴定果树芽变时采用了RAPD这种分子标记,如宁允叶等[8]对红阳猕猴桃金红的芽变系及肖旋等[9]对龙眼大果型桂花味的芽变系鉴定;也有一些研究者采用AFLP这种稳定性强的共显性标记分析芽变,如曾柏全等[3]对冰糖橙的芽变鉴定及李元军等[10]在苹果上的鉴定等｡本研究选择了AFLP这种灵敏的分子标记技术,前期工作主要是大量筛选引物,多数引物组合都没有得到扩增多态性,在部分引物扩增出差异性谱带后,又做了重复性试验,结果有少量引物所得到的多态性并不稳定,在64对引物中,只有9对引物扩增出稳定的差异片段,说明鄂柑一号与其少核芽变的遗传芽变极为微小,AFLP可以有效鉴定柑橘的少核芽变｡参考文献:[1] 陈昭明. 优质丰产椪柑新生系——金水椪柑[J].中国南方果树,2003,32(1):6-7.[2] 房经贵,章镇,周兰华,等. RAPD标记鉴定果树芽变的可行性分析[J]. 果树学报,2001,18(3):182-185.[3] 曾柏全,甘霖,熊兴耀,等. 冰糖橙优良芽变的AFLP分析[J]. 江西农业大学学报,2006,28(7):222-225.[4] 谢吉容, 梁国鲁, 李树发,等. 月季‘金银岛’的红花芽变品系的分析鉴定[J]. 北方园艺,2007,(11):186-189.[5] 程昌凤,何桥,洪林,等. 晚熟甜橙芽变的ISSR鉴定[J]. 西南农业学报,2008,21(5):1378-1380.[6] 母洪娜,曾继吾,易干军,等. 一种快速高效适于柑桔AFLP分析的DNA提取方法[J]. 广东农业科学,2007(3):25-26.[7] VOS P, HOGERS R, BLEEKER M, et al. AFLP: A new technique for DNA finger printing[J]. Nucleic Acids Res, 1995,23(21):4407-4414.[8] 宁允叶,熊庆娥,曾伟光,等. 红阳猕猴桃全红芽变系的RAPD分析[J]. 园艺学报,2003,30(5):511-513.[9] 肖旋,孙敏,王心燕,等. ‘石硖’龙眼大果型桂花味芽变系的RAPD分析鉴定[J]. 园艺学报,2005, 32(4):684-687.[10] 李元军,唐美玲,于青,等. 富士苹果AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用[J]. 园艺学报,2009,36(3):327-332.。