流式细胞仪的分类
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 2、染色同型对照，调节电压尽可能高，一定要能 看到完整的阴性细胞群，大一点的没有太大关系。
• 3、选择细胞群中自发荧光相同的细胞群进行分析 （例如外周血可选择淋巴细胞）。
光学系统－光学滤片
• 长通滤光片 只容许某一波长之上的光通过
• 短通滤光片 容许某一波长之下的光通过
• 带通滤光片 容许某一波长的上下一个极小范围 内的光通，带宽可以特定化
• 流体动力学的聚焦效应（Hydrodynamic Focusing）：大量 的鞘液流包裹少量的样本流，并对样本流在中轴位 置具有聚焦的作用
液流系统－压力系统
液流系统－压力系统
光学系统－光源
• 光束需和细胞或微粒在检测区正交
• 特定的荧光染料需要特定波长的激发光源
• 两类激发光源：
• 激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑， • 弧光灯：光束散交，能量低，位置和功率闪烁，
650 Short Pass
Transmitted
<650 nm
Diflected 90° >650 nm
550 Long Pass
>550 nm <550 nm
单激光光学平台
氩离子激 光器
高感度 PMTs 光电二极管
检测区
光学系统－荧光监测器
• 两种常见的荧光监测器 • 光电二级管:
• 用于强信号的探测 (如, 前向散射光探测器)
• 多参数检测时所必须的
• 数模转换
流式细胞仪的分选功能
• 对细胞或其他微粒的悬液中我们所感兴趣的部分用 具有分选功能的流式细胞仪将之分选出来
流式分选：以流动状态的单个细胞的各项特性进行 细胞分离
流式检测原理
通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各 种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和 荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞 的各种特征。
流式细胞仪的分类
• 台式机型 • 临床型：FACSCalibur，FACSCaLeabharlann Baiduto，FACSCount • 科研型: LSRⅡ，FACSAria，FACSArray
Blocked
>650 nm
Long Pass
550 Long Pass >550 nm <550 nm
Band Pass
600/100 Band Pass 550 - 650 nm (600±50)
<550 nm & >650 nm
LONG (700nm)
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
样本细胞的大小
•
0.5 - 40微米
液流系统－鞘液
• 当液流系统符合雷诺兹公式时，样品流能保持在液 流的中心区流动而不和鞘液混合，即形成层流
• 雷诺兹公式（Reynolds number）
• 当Re < 2300, 液流可以一直保持层流 • 当 Re > 2300, 将会发生湍流
• 非台式机型: FACSVantage SE， FACSDiVa
流式细胞仪的结构组成
液流系统：将待测 样本按一定的速度 一个个通过检测区
光学系统：产生并 收集散射光和荧光 信号
电子系统：光学信 号处理和显示
液流系统－样本流
细胞或微粒的悬浮液通过50－300um的小孔引入鞘液，使得细 胞或微粒单个单个流经检测区
To help all people live healthy lives
流式细胞术－历史回顾 1973年BD推出世界第一台流式细胞仪 FACS I（
Fluorescence Activated Cell Sorter）
1980年中国的第一台流式细胞仪FACS II 生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血
液学、临床检验等领域 FACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国70%
，FACSAria 市场占有率达到90％。
流式细胞术
定义：在流动的状态中检测单个细胞或颗粒的多项理 化及功能性指标的一种分析技术
特点：特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参 数分析
检测的样本种类多样：前提－单细胞悬液 外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，腹水，实体 组织（肿瘤、腺体、淋巴结），培养细胞
荧光补偿的调节
450
500
550
600
650
FITC
PE
FL1 = FITC + x% PE FL2 = PE + y% FITC
荧光补偿的调节
FL2 - %FL1 (0 –30%)
FL-2(PE)
FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 (0 – 1%)
如何进行补偿？
• 1、选择补偿管用的细胞，一定要含有补偿用的抗 体阳性和阴性的细胞群，阳性群体的荧光并尽可能 强。
• 光电倍增管(PMT):
• 比光电二极管更敏感但太强的光会对其造成破坏 • 有最适的波长检测范围
电子系统－数据的采集和处理
• 对探测器检测到的信号加以处理 • 前置放大
• 在从远处的探测器传到中央电子系统前对信号进行放大
• 放大
• 调节信号的强度 • 线性的或对数的放大
• 计算脉冲信号的积分，高度或宽度 • 时间调整
光学系统－散射光信号
• 前向角散射光（FSC):
和细胞或待测颗粒的大小和表面 积有关
可以用来区分死/活细胞
• 侧向角散射光（SSC):
和细胞结构复杂性和颗粒性有关 可以用来区分粒/非粒细胞
光学系统－散射光信号
• 散射光可以用来区分不同细胞群体的最基本的形态差异
- 常常用散点图“Dot Plots”来显示 - 图上的每一个点代表一个细胞的相应信息
• 二向色性 当滤光片和光源成45度角的方向放置，原本
被通过的光照样通过，而原本会被封锁的光将会沿着90度 角的方向被反射出去
Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass
Pass Through Filters
SHORT(500nm)
Transmitted
650 Short Pass <650 nm
Dot Plot (lysed whole blood)
光学系统--荧光信号
• 细胞标记上荧光物质后，这 种荧光物质要求特定波长的 激发光来激发
• 荧光强度是和细胞上标记上 的荧光染料的量正相关
• 荧光在 90°角的方向上检 测
• 荧光物质被激发以后产生的 发射光将由特定的荧光通道 来接收
• 特定检测是通过光学滤片和 透镜来控制的
• 3、选择细胞群中自发荧光相同的细胞群进行分析 （例如外周血可选择淋巴细胞）。
光学系统－光学滤片
• 长通滤光片 只容许某一波长之上的光通过
• 短通滤光片 容许某一波长之下的光通过
• 带通滤光片 容许某一波长的上下一个极小范围 内的光通，带宽可以特定化
• 流体动力学的聚焦效应（Hydrodynamic Focusing）：大量 的鞘液流包裹少量的样本流，并对样本流在中轴位 置具有聚焦的作用
液流系统－压力系统
液流系统－压力系统
光学系统－光源
• 光束需和细胞或微粒在检测区正交
• 特定的荧光染料需要特定波长的激发光源
• 两类激发光源：
• 激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑， • 弧光灯：光束散交，能量低，位置和功率闪烁，
650 Short Pass
Transmitted
<650 nm
Diflected 90° >650 nm
550 Long Pass
>550 nm <550 nm
单激光光学平台
氩离子激 光器
高感度 PMTs 光电二极管
检测区
光学系统－荧光监测器
• 两种常见的荧光监测器 • 光电二级管:
• 用于强信号的探测 (如, 前向散射光探测器)
• 多参数检测时所必须的
• 数模转换
流式细胞仪的分选功能
• 对细胞或其他微粒的悬液中我们所感兴趣的部分用 具有分选功能的流式细胞仪将之分选出来
流式分选：以流动状态的单个细胞的各项特性进行 细胞分离
流式检测原理
通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各 种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和 荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞 的各种特征。
流式细胞仪的分类
• 台式机型 • 临床型：FACSCalibur，FACSCaLeabharlann Baiduto，FACSCount • 科研型: LSRⅡ，FACSAria，FACSArray
Blocked
>650 nm
Long Pass
550 Long Pass >550 nm <550 nm
Band Pass
600/100 Band Pass 550 - 650 nm (600±50)
<550 nm & >650 nm
LONG (700nm)
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
样本细胞的大小
•
0.5 - 40微米
液流系统－鞘液
• 当液流系统符合雷诺兹公式时，样品流能保持在液 流的中心区流动而不和鞘液混合，即形成层流
• 雷诺兹公式（Reynolds number）
• 当Re < 2300, 液流可以一直保持层流 • 当 Re > 2300, 将会发生湍流
• 非台式机型: FACSVantage SE， FACSDiVa
流式细胞仪的结构组成
液流系统：将待测 样本按一定的速度 一个个通过检测区
光学系统：产生并 收集散射光和荧光 信号
电子系统：光学信 号处理和显示
液流系统－样本流
细胞或微粒的悬浮液通过50－300um的小孔引入鞘液，使得细 胞或微粒单个单个流经检测区
To help all people live healthy lives
流式细胞术－历史回顾 1973年BD推出世界第一台流式细胞仪 FACS I（
Fluorescence Activated Cell Sorter）
1980年中国的第一台流式细胞仪FACS II 生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血
液学、临床检验等领域 FACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国70%
，FACSAria 市场占有率达到90％。
流式细胞术
定义：在流动的状态中检测单个细胞或颗粒的多项理 化及功能性指标的一种分析技术
特点：特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参 数分析
检测的样本种类多样：前提－单细胞悬液 外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，腹水，实体 组织（肿瘤、腺体、淋巴结），培养细胞
荧光补偿的调节
450
500
550
600
650
FITC
PE
FL1 = FITC + x% PE FL2 = PE + y% FITC
荧光补偿的调节
FL2 - %FL1 (0 –30%)
FL-2(PE)
FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 (0 – 1%)
如何进行补偿？
• 1、选择补偿管用的细胞，一定要含有补偿用的抗 体阳性和阴性的细胞群，阳性群体的荧光并尽可能 强。
• 光电倍增管(PMT):
• 比光电二极管更敏感但太强的光会对其造成破坏 • 有最适的波长检测范围
电子系统－数据的采集和处理
• 对探测器检测到的信号加以处理 • 前置放大
• 在从远处的探测器传到中央电子系统前对信号进行放大
• 放大
• 调节信号的强度 • 线性的或对数的放大
• 计算脉冲信号的积分，高度或宽度 • 时间调整
光学系统－散射光信号
• 前向角散射光（FSC):
和细胞或待测颗粒的大小和表面 积有关
可以用来区分死/活细胞
• 侧向角散射光（SSC):
和细胞结构复杂性和颗粒性有关 可以用来区分粒/非粒细胞
光学系统－散射光信号
• 散射光可以用来区分不同细胞群体的最基本的形态差异
- 常常用散点图“Dot Plots”来显示 - 图上的每一个点代表一个细胞的相应信息
• 二向色性 当滤光片和光源成45度角的方向放置，原本
被通过的光照样通过，而原本会被封锁的光将会沿着90度 角的方向被反射出去
Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass
Pass Through Filters
SHORT(500nm)
Transmitted
650 Short Pass <650 nm
Dot Plot (lysed whole blood)
光学系统--荧光信号
• 细胞标记上荧光物质后，这 种荧光物质要求特定波长的 激发光来激发
• 荧光强度是和细胞上标记上 的荧光染料的量正相关
• 荧光在 90°角的方向上检 测
• 荧光物质被激发以后产生的 发射光将由特定的荧光通道 来接收
• 特定检测是通过光学滤片和 透镜来控制的