堆肥中生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化

作者简介 收稿日期
李镜( 1983- ) , 女, 湖南江永人, 硕士研究生, 研 究方向: 环 境生物技术。 2009 03 09
表 1 堆肥的成分和性质 Table 1 Components and properties of compost
成分 Components
含量 Content % C %
笔者从农业好氧堆肥中分离筛选出一株能产生生物表 面活性剂的菌株( 该菌株所产生的生物表面活性剂对堆肥环 境具有良好的耐受性, 能够在堆肥反应过程中被利用) , 并在 此基础上, 设计选择培养基, 采用正交优化的方法对菌株的 培养条件进行优化, 为后续的工业化生产储备可用的菌种 资源。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 样品来源。笔者研究的农业好氧堆肥, 采用秸秆和 麸皮作为堆肥的初始物料, 加入农田土壤调节堆肥的初始 C/ N, 同时添加少量树皮作为填充剂, 改善堆体孔隙度。笔者 选取温度为 45 下的堆肥产品作为样品, 于 4 下保存待 用。堆肥的成分和性质见表 1。
37 卷 17 期
李 镜等 堆肥中生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化
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下恒温静置培养 2 d。挑取平板上长势良好的菌落进行划线 分离, 得到纯的菌株。 1. 3 菌株产生的生物表面活性剂对环境的适应性 取已纯 化的菌株在富集培养基中培养 24 h 后, 按 5% 的接种量接种 到发酵培养基中, 初始 pH 值为 7. 0, 发酵温度 30 , 摇床转 速 150 r/ min, 连续培养, 分别进行以下处理后测定发酵液的 表面张力: 连续培养 5 d, 每 24 h 取样, 测定发酵液的表面 张力。 取最适培养时间的发酵液, 分别于 20、30、40、50、60、 70、80、90、100 的温度条件下处理 2 h, 冷却至室温后测定表 面张力。 取最适培养时间的发酵液, 分别用 6 mol/ L 的 NaOH 和 6 mol/ L 的 HCl 将发酵液的 pH 值调节至 6. 0、6. 5、 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5 后测定表面张力。 1. 4 生物表面活性剂产生条件的优化 1. 4. 1 单因素培养条件的选取。将菌株在富集培养基中培 养 24 h 后, 按 5% 的接种量接种到发酵培养基中, 初始 pH 值 为 7. 0, 发酵温度 30 , 摇床转速 150 r/ min, 分别进行以下处 理后测定发酵液的表面张力: 分别以 2% 的葡萄糖、可溶性 淀粉、蔗糖、正十二烷替代植物油作为碳源, 培养 3 d 后进行 测定; 确 定 碳 源 后, 分 别 以 1% 的 ( NH4) 2SO4、NH4NO3、 NaNO3、CO( NH2) 2、NH4Cl 作为氮源, 培养 3 d 后进行测定。 1. 4. 2 培养条件的正交优化。以发酵培养基为基础, 对其碳 源、氮源、酵母浸膏、磷源、EDTA 和微量元素设置不同的水 平, 其他成分水平不变, 初始 pH 值为 7. 0, 温度 30 , 摇床转 速 150 r/ min, 发酵培养 3 d。采用正交试验方法对因素水平 进行优化。 1. 5 菌种鉴定 对筛选所得的菌株进行革兰氏染色、芽孢 染色及生理生化试验鉴定, 确定细菌的种属。 2 结果与分析 2. 1 菌株筛选 堆肥中的微生物种群十分丰富, 且大多对 于堆肥的腐熟和其中难降解有机物的分解有十分重要的作 用。该试验的富集培养基采用植物油作为唯一碳源, 对堆肥 中的微生物进行了初步筛选, 使得能利用脂类的微生物生 长, 而其他微生物的生长受到抑制。经过 3 d 的发酵培养, 发 酵液的表面张力降到 38. 7 mN/ m, 经过平板划线分离得到 6 株菌株。由图 1 可知, 菌株 BS 2、BS 3、BS 5、BS 6 都能使发酵 液的表面张力降到 40 mN/ m 以下, 且在发酵3 d 时, 表面张力 降到最低。因此, 菌株的最佳培养时间为 3 d。
KH2PO4 2. 0 g/ L、K2HPO4 2. 5 g/ L、KCl 1. 1 g/ L、NaCl 1. 1 g/L、MgSO4 0. 15 g/ L、FeSO4 7H2O 5. 0 10- 5 g/ L、EDTA 1. 0 g/ L、酵母浸膏 0. 2 g/ L、初
始 pH 值为 7. 0、温度为 30 、摇床转速为 150 r/ min、发酵培养时间为 3 d。在该条件下, 发酵液的表面张力最低, 为 29. 3 mN/m。[ 结论] 菌株 BS 2初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
堆肥是利用微生物, 人为地促进生物降解有机物向稳定 的腐殖质生物转化的过程[ 1] 。在堆肥过程中, 反应体系内堆 肥颗粒间隙的物化条件对堆肥结果有重要的影响。鉴于堆 肥颗粒间隙是微生物反应的生态微环境, 如何改善这个微环 境, 使之更有利于微生物对有机垃圾的分解, 是提高堆肥处 理效率的关键之一。生物表面活性剂能起到改善微环境的 作用, 它是一种由微生物产生的、适合存在于憎水性有机化 合物中的物质[2] , 可很好地连接不同相的界面, 如固液相之 间、气液相之间的界面, 降低它们的表面张力和界面张力[ 3] 。 生物表面活性剂还可增加憎水性有机化合物与液相之间的 接触面, 从而增加憎水性有机化合物的含水量, 提高微生物 对其的利用率[ 4] 。
of 3 d. Under this condition, the lowest surface tension of the broth was measured as 29. 3 mN/ m. [ Conclusion] The strain BS 2was preliminarily identi fied as Bacillus subtilis. Key words Compost; Biosurfactant; Surface tension; Orthogonal optimized experiment
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2009, 37(17) : 7884- 7886, 7888
责任编辑 金琼琼 责任校对 傅真治
堆肥中生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化
李 镜, 刘红玉, 曾光明, 武金装, 刘 伟, 张琳达 ( 湖南大学环境科学与工程系, 湖南长沙 410082)
秸秆 Stalk
40. 3
43. 6
麸皮 Bran
39. 3
49. 7
农田土壤 Farmland soil
Hale Waihona Puke Baidu
20. 4
18. 9
初始物料 Raw materials
41. 0
N%
0. 8 1. 1 3. 1 1. 4
C/ N
56. 6 46. 4 6. 1 30. 0
1. 1. 2 培养基。 富集培养基: ( NH4) 2SO4 10. 0 g, KCl 1. 1 g, NaCl 1. 1 g, FeSO4 7H2O 2. 5 10- 5 g, KH2PO4 3. 4 g, MgSO4 0. 5 g, EDTA 1 g, 酵母浸膏 0. 5 g, 植物油 20 ml, 用蒸馏水定容至 1 L[ 5] 。 平板及斜面培养基: 葡萄糖 16 g, 蛋白胨 4 g, 酵母 浸膏 0. 2 g, 琼脂 20 g, 蒸馏水定容至 1 L。 发酵培养基: 发 酵培养基为富集培养基中添加 1 ml 的微量元素, 其微量元素 成分为 ZnSO4 0. 29 g/ L, CaCl2 0. 24 g/ L, CuSO4 0. 25 g/ L, MgSO4 0. 17 g/ L。 1. 2 菌株筛选 1. 2. 1 样品稀释。取 10 g 堆肥样品置于烧杯中, 加入 90 ml 无菌水, 充分搅拌振荡后, 静置 30 min, 吸取上悬液 1 ml, 加入 9 ml 无菌水中, 制成样品悬液。 1. 2. 2 富集培养。将上述样品悬液按 5% 的接种量接种到富 集培养基中, 于 30 、150 r/ min 条件下, 振荡培养 3~ 4 d( 视 培养浊度而定) 。 1. 2. 3 菌种的纯化。取富集培养液按 5% 的接种量接种到发 酵培养基中, 于上述条件下连续培养, 直至观察到乳化现象。 取发酵液按 5% 的接种量再次接种到新的发酵培养基中继续 培养, 每 24 h 取样, 用 JYW 200A 自动界面张力仪测定发酵液 的表面张力。取表面张力低于 40 mN/ m 的发酵液 1 ml 稀释 至 10- 3之后, 以该稀释发酵液 1 ml 涂布平板培养基, 于 37
摘要 [ 目的] 筛选堆肥中生物表面活性剂产生菌, 优化其培养条件。[ 方法] 采用富集培养、菌种纯化等方法从农业好氧堆肥中筛选出 能产生生物表面活性剂的菌株, 并采用正交试验对菌株的培养条件进行优化。[ 结果] 从农业好氧堆肥中筛选出 1 株能产生生物表面活
性剂的菌株 BS 2, 该菌株能将发酵液的表面张力降到 40 mN/ m 以下, 在温度 20~ 100 和 pH 值 6. 0~ 9. 5 条件下, 其表面张力始终保持 在 40 mN/ m 以下, 具有良好的表面活性及对堆肥环境的稳定性。该菌株的最佳培养条件为: 可溶性淀粉 25. 0 g/ L、NH4NO3 8. 0 g/ L、
关键词 堆肥; 生物表面活性剂; 表面张力; 正交优化试验 中图分类号 S 188 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2009)17- 07884- 03
Optimization on the Screening and Culture Condition of Biosurfactant producing Bacteria from Compost LI Jing et al ( Department of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha, Hunan 410082) Abstract [ Objective] The study aimed to screen out piosurfactant producing bacteria from compost and optimize its culture condition. [Method] The strains which could produce biosurfactant were screened from the agriculture aerobic compost samples with methods of enrichment culture and strain purifi cation ect. and the cultural condition of strain was optimized through orthogonal test. [Result] A strain BS 2 that could produce biosurfactant was screened out from the agriculture aerobic compost, which could decreased the surface tension of broth below 40 mN/ m and keep the same level under the tempera ture of 20- 100 and pH of 6. 0- 9. 5, showing its good surface tension and adaptability in composting environment. The optimized fermentation condi tions were as follows: soluble starch 25. 0 g/ L, NH4NO3 8. 0 g/ L, KH2PO4 2. 0 g/L, K2HPO4 2. 5 g/ L, KCl 1. 1 g/L, NaCl 1. 1 g/ L, MgSO4 0. 15 g/ L, FeSO4 7H2O 5. 0 10- 5 g/L, EDTA 1. 0 g/ L, yeast paste 0. 2 g/L, initial pH of 7. 0, temperature of 30 , rotation speed of 150 r/ min, culture time