GUS 活性检测protocol
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样品测定，200μl样品反应终止液，加入1.8ml 0.2MNa2CO3，记录数据
↓
12.000x g,20min, 4℃离心，收集上清
↓
Bradford法测定提取液总蛋白浓度，适当调整浓度
（酶反应体系中总蛋白浓度为1μg）
↓
酶反应：取1μg总蛋白，加入含1mM MUG的GUSextraction buffer使反应体系为1ml，
37℃孵育20min，每200μl反应液加入800μl0.2M Na2CO3终止反应
（1mM MUG：0.00406g MUG/10ml buffer
参照设置：加入与蛋白等体积的buffer一起反应，荧光分光光度计检测时用于调零）
↓
荧光分光光度计检测：参数设置Ex=360nm，Em=465nm，Slit wid，吸取200μl参照反应终止液，加入1.8ml 0.2MNa2CO3
GUS活性测定方法
GUSextraction buffer:50 mM NaPO4,pH 7.0
10 mM EDTA
10 mMβ-ME(巯基乙醇)
0.1% N-Lauryl-Sarcosine(十二烷基肌氨酸钠)
0.1% TritonX-100
complete protease inhibitor
步骤：
提取烟草蛋白：已研磨的烟草样品加入等体积的GUSextraction buffer
（使用前加入十二烷基肌氨酸钠，酶抑制剂cooktail和PMSF，），充分裂解
(1ml 10xcooktail/10ml buffer;100μl 100xPMSF/10ml buffer; 7μl十二烷基肌氨酸钠/10ml buffer)
↓
12.000x g,20min, 4℃离心，收集上清
↓
Bradford法测定提取液总蛋白浓度，适当调整浓度
（酶反应体系中总蛋白浓度为1μg）
↓
酶反应：取1μg总蛋白，加入含1mM MUG的GUSextraction buffer使反应体系为1ml，
37℃孵育20min，每200μl反应液加入800μl0.2M Na2CO3终止反应
（1mM MUG：0.00406g MUG/10ml buffer
参照设置：加入与蛋白等体积的buffer一起反应，荧光分光光度计检测时用于调零）
↓
荧光分光光度计检测：参数设置Ex=360nm，Em=465nm，Slit wid，吸取200μl参照反应终止液，加入1.8ml 0.2MNa2CO3
GUS活性测定方法
GUSextraction buffer:50 mM NaPO4,pH 7.0
10 mM EDTA
10 mMβ-ME(巯基乙醇)
0.1% N-Lauryl-Sarcosine(十二烷基肌氨酸钠)
0.1% TritonX-100
complete protease inhibitor
步骤：
提取烟草蛋白：已研磨的烟草样品加入等体积的GUSextraction buffer
（使用前加入十二烷基肌氨酸钠，酶抑制剂cooktail和PMSF，），充分裂解
(1ml 10xcooktail/10ml buffer;100μl 100xPMSF/10ml buffer; 7μl十二烷基肌氨酸钠/10ml buffer)