产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究
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浙江大学
硕士学位论文
产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究
姓名：刘静
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：闵航
20050501
浙江大学硕士学位沦文
图１＋１菌株扫描电镜０５０００ｘ）
ＦｉｇＪ．ＩＴｈｅｃｅｌｌｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｓｔｒａｉｎＨＬ２２１．
图１．２长期处于不同温度培养条件下菌株形态比较（１００００×）左图：４＂Ｃ右图：２０＂ＣＦｉｇ．１，２Ｔｈｅｃｅｌｌｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆｓｔｒａｉｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．３．２．２耐药性、耐盐度、温度、ｐＨ
耐药性结果如图１１３所示，庆大霉素（１０／ａｇ／ｍＬ）、硫酸卡那霉素（１０ｕ．ｇ／ｍＬ）、红霉索（１０ｐ．ｇ／ｍＬ）、青霉素（８０／ａｇ／ｍＬ）和氨苄青霉素（１００／ａｇ／ｍＬ）均能抑ＳＦＪＨＬ２２１菌株的生长，而氮霉素（１０ｐ．ｇ／ｍＬ）无抑菌效果。ＨＬ２２１能，在４℃－３０℃生长，最适生长温度范围１５９Ｃ－２５＂Ｃ。盐浓度超过５％，不生长。在ｐＨ６－１０的条件下生长，最适生长ｐＨ７．０。
３．２．３其他生理生化特性
该菌为好氧型代谢。发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖产酸，均不产气。甲基红反应阴性，Ｖ．Ｐ反应阴性，吲哚反应阳性。水解明胶，不水解淀粉。Ｇ＋Ｃｍ０１％为３４．３％。
浙江大学硕士学位论文各项生理生化特征见表１．１。
图１－３分离菌株的抗生索敏感性
Ｆｉｇ．１．３Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｔｏｓｏｍｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
Ｉ：氨苄青霉素２：红霉素３：卡那霉素４：氯霉素５：青霉素６：庆大霉素
表ｌ，１分离菌株的生理生化特征
Ｔａｂｌｅ１．１ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｔｒａｉｎＨＬ２２ｌ
试验项目反应特征试验项目反应特征
抗生素产气一庆大霉鬃（］０¨ｇ／ｍＬ）一甲基红反应一
硫酸卡那霉素（１０ｐ．ｇ／ｍＬ）一ＶＰ反应一红霉索（１０ｌＩ．ｇ／ｍＬ）一吲哚反应＋
青霉素（８０＂∥ｍＬ）一明胶液化＋氨苄青霉素（１００ｐｅｄｍＬ）一淀粉水解＋氯霉索（１０“ｇ／ｍＬ）＋生长温度４＂Ｃ－３０℃发酵试验最适生长温度１５＂Ｃ－２５．ｃ
葡萄糖＋生长ｐＨ范围６－１０
蔗糖＋最适生长ＤＨ值８．０
麦芽糖＋生长盐浓度≤５％
产酸＋Ｇ＋Ｃｔｏｏｌ％３４３
（＋，反应为阳性；一，反应为阴性）
变后的菌种与原始菌种在菌体形态上有所差异。诱变后的菌落形态、色泽与原菌落无明显区别。
表２．１紫外诱变对菌株存活率影响
Ｔａｂｌｅ２．１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＵＶｔｒｅａｔｍｅｎｔＯｎｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＨＬ２２１
表２２不同照射时间对菌株酶活影响
Ｔａｂｌｅ２．２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＵＶｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＨＬ２２Ｉ
图２．１诱变后菌株与出发菌株的菌体形态比较（左图：诱变菌株右图：出发菌株）
Ｆｉｇ．２．１Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｏｆｔｗｏｓｔｒａｉｎｓ・
２２
条带，表明蛋白酶已达到电泳纯。
２６１２ｌ５１８２ｌ２４２７
０４０，３５
Ｏ３０２５盆０．２ｄ０１Ｐ０１０．０５０
图４．２ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ柱层析
Ｆｉｇ４．２ＴｈｅｅｌｕｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
表４．１
ＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐＨＬ２２１低温ｔ蛋白酶的分离纯化结果Ｔａｂｌｅ４．ｉＡｓｕｍｍａｒｙｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＨＬ２２１
Ａ：ｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔ
Ｂ：ａｎｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ
Ｃ：ＳｅｐｈｄｅｘＧ一７５ｆｒａｃｔｉｏｎ
Ｄ：ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＥＦ．ｆｒａｃｔｉｏｎ
ＡＢＣＤ
图４．３各步提纯样品的ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．４．３ＰＡＧＥｐａｔｔｅｒｎｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｅｐｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
叮
：呈¨
¨
∞
啦
叫
。
窘口口。
２．２酶学性质
２．２．１蛋白酶的分子量和等电点的测定
纯化后的蛋白酶在１０％的ＰＡＧＥ中显示单一的条带，在ＳＤＳ．ＰＡＧＥ中也显示为单一条带，如图４．４所示，通过与标准蛋白的比较计算，得到其分子量约为３５０００Ｄａ。对酶进行等电聚焦电泳测定，测得其等电点约为４．９。
ＭＰ
６６２００——＋
４３０００－＇－｝
３１０００－－－｝
２０１００－－－｝
１４４００斗
图４．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定蛋白酶分子量
Ｆｉｇ．４．４ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＳＤＳ・ＰＡＧＥ
Ｍ：Ｓｔａｎｄａｒｄｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ．
２．２．２最适温度和热稳定性
纯酶液与酪蛋白溶液等体积混和，在１０。Ｃ一４５。Ｃ的温度下反应１０ｍｉｎ，从图４５可以看出，反应温度在２５＂Ｃ时酶活力最大，高于３０＂Ｃ酶活力下降较快。在无底物存在的情况下，２５＂Ｃ保温１ｈ保留７０％左右的酶活力；４５＂Ｃ保温１ｈ后，仅剩余１０％
酶活。随着温度的升高，酶的热稳定性越低。
２．３．３最适ｐＨ和对ｐＨ的稳定性