仪器分析实验

r=± x=
b=
i=1
n
(xi - x)(yi - y)

i=1
n
a = y - bx (xi - x)2

i=1
n
xi y=

i=1
n
yi
n
n
n

i=1
(xi - x)(yi - y)
2

i=1
n
(xi - x)

i=1
n
1/2
yi - y)
2
s=
dx dc
或
s=
dx dm
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二、灵敏度（Sensitivity） 被测物质单位浓度或单位质量的变化引起响应信号值变化的 程度，称为方法的灵敏度，用S表示。 根据国际纯粹与应用化学联合会（简称IUPAC）的规定，灵敏 度是指在测定浓度范围中标准曲线的斜率。在分析化学中使用的 许多标准曲线都是线性的，一般是通过测量一系列标准溶液来求 得，可用下式表示：
可见光：400-780 nm，可被人们的眼睛所感觉
特点：带光谱 分子光谱
应用：定性分析-最大吸收波长
定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）
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定性分析原理
吸收曲线：吸收峰的数 目、位置、相对强度以 及吸收峰的形状
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定量分析原理
根据朗伯－比耳定律： A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一
3sbl 3 0.024 Lc 0.010 （mg/mL） S 6.915
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定量分析方法
标准曲线法 标准加入法 归一化法（色谱）
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紫外-可见吸收光谱法
又称紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可 见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 紫外光：10-400 nm
光 源
单 色 器
吸 收 池
检 测 器
信号显示 记录装置
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紫外分光光度法测定蛋白质含量 实验目的 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了 解此仪器的主要构造。
定性、定量（标准曲线法）
对于光学分析方法，可以与空白信号区别的最小信号XL。以下式确定
式中Xb为空白信号的平均值，sb为空白信号的标准偏差，k为根椐一定 的置信水平确定的系数，IUPAC(国际纯粹及应用化学联合会)建议k 值 取 3。能产生响应信号为 XL-Xb的被测物质的浓度或量就是方法对该物 质的检出限，用DL表示。
式中S是方法的灵敏度。1位有效数字
常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态
分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以 辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：
I F 2.303 I 0bc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
峰电流平均值（nA）
0.060
0.452
0.100
0.732
0.140
1.014
0.180
1.288
0.220
1.442
0.260
1.480
0.300
1.500
说明：空白溶液测定10次，标准偏差s为0.024 (mg/mL，这个值要自己会 计算), 标准溶液测定次数为3次。 （1）试绘制标准曲线；（2）写出标准曲线的一元线性回归方程，确定 其线性范围和该方法的灵敏度； 3）试计算该方法的检出限。
3. 线性范围 校准曲线的直线部分所对应的 被测物质的浓度或量的范围叫作该方法测定 这种物质的线性范围。一般说来，好的分析 方法应有较宽的线性范围。 图1-1 伏安法校准曲线 曲线的横坐标是试液的浓度C 纵坐标是峰电流
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这种线性关系可以用一元线性
y = a + bx
回归法求出
b 叫回归系数即回归直线斜 率，也就是方法的灵敏度。 r 叫相关系数，表示线性关系 的好坏。 r 值 在 +1.0000 与 -1.0000 之间 。 当越接近1，则y与x之间的线性 关系就越好。
式中x为样品含量的测定值，μ为样品含量的真值。 准确度是分析过程中系统误差和随机误差的综合反映，它 决定着分析结果的可靠程度。方法有较好的精密度且消除了 系统误差后，才有较好的准确度。
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“3S+2A”
“3S+2A”，即Sensitivity（灵敏度）， Selectivity（选择性 ），Speediness（速度）, Accuracy（准确度）, Automation （自动化程度） IUPAC 建议将精密度、准确度和检出限三个指标作为分析 方法的主要评价指标。
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实验原理
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质
含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环
含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外 光 的性质，其 最大吸收峰位 于 280 nm 附 近
280nm
275nm
（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最
大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度 的关系服从朗伯-比耳定律。
定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。
标准曲线法：只要绘出以吸光度 A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲 线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样 的含量。
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仪器组成部件
各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是 由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装 置。
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注意事项： • 实验预习报告（检查、记录数据、签字） • 实验报告（数据记录和处理） • 实验服、实验室卫生、实验室安全和路途安全 • 实验小组（6组，轮流实验，6周）
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仪器分析
定性分析
定量分析方法的评价指标
一、标准曲线 二、灵敏度 三、精密度 四、检出限
五、准确度 化学化工学院
一、标准曲线
1. 标准曲线 标准曲线又称校准曲线，是被测物质的浓 度或量与仪器响应信号的关系曲线，用标准 溶液或标准物质绘制。 2. 标准曲线的绘制
标准曲线是依据一系列被测物质的标准 溶液浓度（或含量）和其响应信号测量值来 绘制的。只要在与校准曲线的相同的实验条 件下测得样品溶液的峰电流，即可在校准曲 线上求得样品溶液中被测物质的浓度C。
dx S dc
S dx dm
式中：dc 和dm 分别为被测物质的浓度和质量的变化量，dx为 响应信号的变化量。标准曲线的斜率越大，方法的灵敏度就越高 。
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三、精密度(precision)
使用同一方法，对同一试样进行多次测定所得结果的一致程 度（重复性和再现性）。 重复性 同一分析人员在同一条件下平行测定结果的精密度 又称重复性。 再现性 不同实验室所得测定结果的精密度又称再现性。 精密度常用测定结果的标准偏差s或相对标准偏差量度。
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解：（ 1 ）利用实验所得数据在 Excel 软件表中按浓度为 A 列和 峰电流平均值为B列制表。使用Excel软件绘制标准曲线，见图 。
（2）使用Excel软件绘制线性标准曲线，见图1-3。由图1-3确定一 元线性回归方程为I(nA)=6.915c +0.036 ( c单位为mg/mL), 相关系数 平方值为0.9997，线性范围为0.02~0.22 mg/mL，方法在线性范围内 的灵敏度为6.915 nA/ mg/mL。 化学化工学院
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实验预习
预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 预习紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验步骤。 了解TU-1901紫外-可见分光光度计的主要构造。
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仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管 标准蛋白质溶液：3.00 mg.mL-1溶液 0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液 （牛血清白蛋白）
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基本操作
1. 启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。 2. 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择 光度测量，设置测量条件（测量波长等）。 3. 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。 4. 标准曲线的制作。
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实验步骤
仪器分析实验
漆红兰
honglanqi@
8202 化学化工学院
仪器分析实验
组成：共6个实验，分6个大组 光 3个实验 （紫外-可见、荧光、原子吸收） 紫外分光光度法测定蛋白质含量（2组） 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量（2组） 原子吸收光谱法测定钙最佳实验条件的选择（1组） 电 1个实验 循环伏安法测定亚铁氰化钾（2组） 色谱 2个实验（气相色谱、液相色谱） 苯、甲苯、乙苯混合物的分离与定量分析（1组） 反相色谱法测定样品中尼泊金甲酯的含量（1组） 仪器参观 1个实验（1组，附加） pH计的使用 （2组，附加）
发射光谱
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
1.吸收曲线的绘制和最大吸收波长的选择： 用吸量管分别吸取1.0 mL 3.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于10 mL 比 色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。 用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在190-400 nm区间， 扫描获得吸收曲线。选择最大吸收波长。 2. 标准曲线的制作 ： 用吸量管分别吸取0.5 、1.0、 1.5 、2.0 、2.5 mL 3.00 mg.mL-1标准 蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇 匀。 用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm（选定波长 下）处分别测定各标准溶液的吸光度A280，记录所得读数。 3. 样品测定： 取待测蛋白质溶液3 mL，按上述方法测定280 nm处的吸光度。平 行测定三份。
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数据处理
1. 2.
绘制吸收曲线。 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3. 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
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分子发光分析法
• 分子发光分析法包括分子荧光分析法，磷光分析法、
化学发光分析法和生物发光分析法。
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实验原理
荧光分析法
I F Kc
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
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荧光分析法的特点
a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定
物质。
c. 所需试样量少、操作方法简便。
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荧光光谱
激发光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化物发射的荧光强度与 照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多， 荧光强度最大。
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检出限与灵敏度关系 灵敏度高，精密度好，检出限低 灵敏度是分析信号随被测物质含量变化的大小，与仪器信号的 放大倍数有关 检出限与空白信号波动或仪器噪音相关，具有明确的统计学含 义。 检出限是方法灵敏度和精密度的综合指标
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五、准确度(Accuracy)
样品含量的测定值与样品含量真实值(亦称真值)相符合的 程度称为准确度。准确度常用相对误差量度。
1.8 1.6 1.4 y = 6.9147x + 0.0355 R2 = 0.9997
Peak Current/ nA
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Concentration of Pb2+/ mg/mL
线性标准曲线图
（3）计算该方法的检出限为：

s=
i=1
n
(xi - x)2
n -1
s × 100% sr = x
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四、检出限（Detection Limit）
某一方法在给定的置信水平上可以检出被测物质的最小浓度或最小质 量称为这种方法对该物质的检出限，以浓度表示的称为相对检出限，以 质量表示的称为绝对检出限。检出限是一个定性概念，只表明此浓度或 量的响应信号可以与空白信号相区别。在检出限附近不能进行定量分析。
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用某伏安分析新分析法测定试样中的铅离子浓度，获得如下数据：
铅离子浓度(mg/mL) 峰电流平均值（nA） 0.000 1.480 0.002 0.042 0.005 0.052 0.010 0.076 0.020 0.164 0.030 0.228 0.040 0.312
铅离子浓度(mg/mL)