石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片HE染色
石蜡切片HE染色1.脱蜡：二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3中各浸泡10分钟。
梯度酒精复水（100％100％，100％，95％，80％，70％）各5分钟。
2.清洗：用PBS洗1次，3分钟。
3.苏木素染色：取苏木素染液用去离子水按1：4稀释，然后染色约5 min（具体时间根据染色的组织而定，一般看到核有较深的蓝紫色就可以了）。
用自来水终止染色。
4.分化：染色后的切片在0.1%盐酸酒精分化3~5 s（具体时间根据染色的情况而定，分化的目的主要是让胞质与核的染色能够区分开，苏木素染色过了的话也可以通过分化后重新染色，这时处理时间需要长一些，如果分化过头即片子着色不深的时候可以再用苏木素染色)。
5.返蓝：分化后的片子置于自来水中，流水返蓝10～30min（具体时间根据染色情况而定，苏木素在碱性溶液中呈蓝色，别人做的时候都是先用弱碱性溶液返蓝后再用自来水冲洗，用时较短，我们是直接用自来水返蓝，由于自来水呈弱碱性，可以达到返蓝效果）。
6.伊红染色：伊红染液用95%酒精按1：1配制成工作液（伊红的贮备液瓶子上有注明），染色30s~1min（时间根据染色情况调整，建议是染深一点好，因为所用的染色伊红为水溶性，弱醇溶性的，在后面的脱水透明的时候非常容易掉色），染色后用去离子水洗1～3s（放在去离子水缸中立即拿去脱水透明）。
7.脱水透明：通风橱里梯度酒精（95％，100％，100％）脱水各30s，二甲苯1，二甲苯2，二甲苯3透明各3分钟。
（说明：这是我做的时候的步骤，因为按照一般的脱水透明的步骤，最后伊红的着色一般都没有了，原因我前面也说了是由于伊红为水溶性弱醇溶性的，但是按着这样的步骤比较容易污染95%酒精，后来看了相关的资料我的想法是伊红染色后先用95%酒精洗一下，再去通风橱从95%酒精梯度脱水，这样不会污染。
）8.封片：中性树胶封片（一般两滴就够了，从二甲苯中拿出时建议尽量不要让二甲苯干，这样中性树胶能够很快分散开，不会形成气泡）。
石蜡切片制备基本步骤(附HE染色步骤)
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤石蜡切片和HE染色方法与步骤1(取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织(或其他组织)。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2,3mm厚。
注意事项:(1)取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2(固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30,50min。
注意事项:(1)一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
(3)固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
(4)材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
3. 脱水50%酒精?70%酒精?80%酒精?95%酒精?100%酒精?100%酒精。
每级0.5h。
注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
(2)在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
(3)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
(4)在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
(5)如需过夜，应停留在70%酒精中。
(6)脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象4. 透明1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) ?纯二甲苯(1.5h) ?纯二甲苯(1.5h)。
染色步骤
HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。
㈠染色程序1．石蜡切片HE染色（常规HE染色）（1）二甲苯Ⅰ 5～10min（2）二甲苯Ⅱ 5～10min（3）无水乙醇Ⅰ 1～3min（4）无水乙醇Ⅱ 1～3min（5）95%乙醇Ⅰ 1～3min（6）95%乙醇Ⅱ 1～3min（7）80%乙醇 1min（8）蒸馏水 1min（9）苏木素液染色 5～10min（10）流水洗去苏木素液 1min（11）1%盐酸-乙醇 1～3s（12）稍水洗 1～2s（13）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（14）流水冲洗 1～2min（15）蒸馏水洗 1～2min（16）0.5%伊红液染色 1～3min（17）蒸馏水稍洗 1～2s（18）80%乙醇 1～2s（19）95%乙醇Ⅰ 2～3min（20）95%乙醇Ⅱ 2～3min（21）无水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min（22）无水乙醇Ⅱ 3～5min（23）石炭酸-二甲苯 3～5min（24）二甲苯Ⅰ 3～5min（25）二甲苯Ⅱ 3～5min（26）二甲苯Ⅲ 3～5min（27）中性树胶封固注：①（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
②（23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。
2．冰冻切片HE染色（1）冰冻切片固定 10～30s（2）稍水洗 1～2s（3）苏木素液染色（60℃） 30～60s（4）流水洗去苏木素液 5～10s（5）1%盐酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s（6）稍水洗 1～2min（7）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s（8）流水冲洗 15～30s（9）0.5%伊红液染色 1～2min（10）蒸馏水稍洗 1～2min（11）80%乙醇 1～2min（12）95%乙醇 1～2min（13）无水乙醇Ⅰ 1～2min（14）无水乙醇Ⅱ 1～2min（15）石炭酸-二甲苯 2～3min（16）二甲苯Ⅰ 2～3min（17）二甲苯Ⅱ 2～3min（18）中性树胶封固注：①（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
石蜡切片制作和HE染色实验报告
石蜡切片制作和HE染色实验报告实验目的：
本实验旨在掌握石蜡切片制作和HE染色的方法，以便观察组织结构和细胞形态。
实验步骤：
1. 用福尔马林固定组织标本。
2. 将组织标本脱水处理，然后浸泡于熔化的石蜡中。
3. 将石蜡浸渍的组织标本置于模具中，待石蜡凝固后，用切片机切割成薄片。
4. 将切片置于载玻片上，进行HE染色。
5. 用显微镜观察切片的组织结构和细胞形态。
实验结果：
通过石蜡切片制作和HE染色，成功获得了组织切片，并且染色
效果良好。
在显微镜下观察，可以清晰地看到组织细胞的形态和结构，染色也使细胞核和细胞质染色成不同的颜色，便于观察和分析。
实验分析：
石蜡切片制作和HE染色是常用的组织学实验方法，可以有效地
观察和研究组织结构和细胞形态。
本次实验结果表明，我们掌握了
石蜡切片制作和HE染色的技术要点，能够准确地进行实验操作并获
得良好的实验结果。
实验总结：
通过本次实验，我们深入了解了石蜡切片制作和HE染色的方法
和原理，掌握了实验操作的技巧，并且获得了明确的实验结果。
这
将为我们今后的组织学研究和临床诊断提供重要的技术支持。
同时，我们也意识到在实验操作中需要严格控制每个步骤，以确保实验结
果的准确性和可靠性。
自查结论：
本次实验取得了成功的实验结果，但在实验过程中仍需注意细节操作，确保实验的准确性和可靠性。
同时，还需要进一步加强对石蜡切片制作和HE染色的理论知识和实验技术的掌握，以提高实验操作的熟练度和实验结果的稳定性。
石蜡包埋和HE染色的制作过程
步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
步骤一：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
步骤四：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？步骤五：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
————又要脱水！⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
步骤六：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
又要用一次无水酒精，这是为什么？步骤七：封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。
组织胚胎学研究方法和技术—石蜡切片与HE染色
是最常用的经典技术
02 石蜡切片术基本步骤
取材和固定 脱水和包埋 切片和染色 封片ห้องสมุดไป่ตู้
03 HE 染色
最常用的染色方法是苏木精和伊红染色法，简称HE 染色法
原理： 苏木精（Hematoxylin）-- 伊红（Eosin）
碱性染料
酸性染料
嗜碱性
将嗜碱性物质 （本身酸性）
构具有被碱性染料着色的性质称嗜碱性。
光镜技术— 石蜡切片术和HE染色
目录
CONTENT
01 光镜技术概述
02 石蜡切片术
03 HE染色
01 光镜技术概述
应用一般光学显微镜(简称光镜)观察是组织学研究的最基本方法 放大倍数可达1500，分辨率约为0.2μm 光镜下能被分辨的微细结构称光镜结构（LM） 组织学研究需要制备能使光线透过、微细
染成蓝色
中性
细胞核中的染色质、 细胞质中的核糖体
将嗜酸性物质 （本身碱性） 染成红色
嗜酸性
细胞质、膜性结构（线粒体、溶 酶体、滑面内质网）、细胞间质
脑垂体，H&E, x400
特殊染色法
镀银染色法
醛复红染色法
活体染色法
小结
1. 组织学最常见的研究方法是采用光镜观察。 2. 石蜡切片术是光镜观察时标本制备最常用的经典技术。 3. 组织切片常用的染色法是苏木精—伊红染色法，称HE染色。 4. 凡组织结构具有被酸性染料着色的性质称嗜酸性，凡组织结
he染色分化、反蓝的步骤
he染色分化、反蓝的步骤
HE染色分化、反蓝的步骤如下：
1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ
10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%酒精5min-90%酒精
5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
2. 苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。
3. 伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
4. 脱水封片：将切片依次放入95%酒精Ⅰ5min -95%酒精Ⅱ5min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min，二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
具体的染色步骤和时间可能会因组织类型、染色方法和实验室条件等因素而有所不同，建议在进行染色实验前仔细阅读相关实验指导或咨询专业人士。
组织石蜡包埋切片和HE染色的基本流程
3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。
4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。
苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。
12、80%乙醇5min
13、伊红液（95%乙醇溶液）3~30seconds
14、95%乙醇Ⅰ1min
Ⅱ5min
15、无水乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5min
16、二甲苯+乙醇（1：1）5min
17、二甲苯Ⅰ5min
Ⅱ5min
Ⅲ5min
18、中性树胶封片。
HE染色注意事项：
1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
Ⅱ5min
3、95%乙醇Ⅰ5min
Ⅱ5mn
4、80%乙醇5min
5、70%乙醇5min
6、D．W．3~5min
7、Harris苏木素液5min（冬天可适当延长，eg.20min）
HE染色实验步骤
石蜡切片和HE染色
A：0.5~1% 的伊红酒精溶液：
称取伊红Y 0.5~1 g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列减少)
苏木精6 g
无水乙醇100 ml
硫酸铝钾150 g
蒸馏水2000 ml
碘酸钠1.2 g
冰醋酸120 ml
甘油900 ml
配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可
石蜡切片
1、将组织放入生理盐水中冲洗干净后，放入4%多聚甲醛固定固定时间不低于3
小时，甲醛体积应为组织体积的10-15倍。
2、自来水冲洗30min→75%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇1h→无水乙醇I
40min→无水乙醇II 40min→二甲苯I 20min→二甲苯II 20min→石蜡I 40min→石蜡II 40min（注意：提前2h将石蜡放入70℃的水浴锅或者烘箱中融化。
注：石蜡熔点62℃）。
3、提前1h将石蜡倒入包埋仪中融化，包埋机包埋。
切片机切片。
4、石蜡包埋切片。
石蜡切片的制作及HE染色课件
取材的大小和厚度也会影响后续 的切片制作，一般而言，组织块 的大小应为2-3cm³，厚度在24mm之间。
固定
固定是为了防止组织自溶和腐败，保 持组织细胞的形态和结构。常用的固 定剂有甲醛、乙醇、丙酮等。
固定时需要将组织放入适当的固定液 中，固定时间一般为1-24小时，具体 时间根据组织类型和大小而定。
04
石蜡切片制作及HE染色的质量控制
切片厚度控制
切片厚度
石蜡切片的厚度应控制在2-5微米之间， 过薄或过厚都会影响染色效果和显微镜 观察。
VS
切片均匀度
确保切片厚薄均匀，无裂痕或气泡，以提 高染色和观察的准确性。
染色浓度与时间控制
染色浓度
根据组织类型和染色需求，选择合适的染色浓度，以达到最佳染色效果。
01
02
03
04
防止脱片
在染色过程中要保持切片的湿 润，避免脱片。
控制染色时间
染色时间不宜过长或过短，应 根据实际情况进行调整，以达
到最佳染色效果。
注意染液浓度
染液的浓度要适中，过浓或过 淡都会影响染色效果。
避免污染
在染色过程中要保持染缸的清 洁，避免污染影响染色效果。
03
石蜡切片HE染色结果分析
浸蜡
浸蜡是为了将石蜡渗透到组织中，使组织变得硬固，以便 切片。常用的石蜡有固体石蜡和液体石蜡。
浸蜡时需要将组织放入适当的石蜡中，时间一般为1-2小 时，具体时间根据组织类型和大小而定。
包埋
包埋是将组织用石蜡包裹起来，以便 切片。包埋时需要将组织放入包埋盒 中，并确保组织平整、无气泡。
包埋盒需要用标签标记清楚，以便后 续的切片和观察。
染色时间
染色时间的长短也会影响染色效果，时间过短会使染色不明显，时间过长则可能导致染 色过度。
HE染色(石蜡切片)
透明的目的是将与石蜡结合的媒介剂（二甲 苯）浸入组织，并将不能与石蜡结合的脱水剂 （酒精）置换出来，为了更好的浸蜡和包埋，并 使组织透明。常用的透明剂是二甲苯，二甲苯透 明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块在 二甲苯中不宜久留，小块组织以30min为宜，较 大的组织块可适当延长，但不能超过2h。
和细胞内的核糖体染成蓝紫色；伊红是一种酸性 染料，将嗜酸性的细胞质染成红色或淡红色。在 HE染色中，细胞核的染色至关重要。
（1）脱蜡：染色前，必须将石蜡切片中的石蜡去 除，否则水溶性染料不能与组织结合，这一步称 为脱蜡。脱蜡程序与脱水包埋恰好相反，先将切 片置于二甲苯中使石蜡溶解（5~10分钟），再由 高到低的酒精水化：无水酒精→95%→85%→70% （各级2~5分钟），然后经蒸馏水转入染缸。
（4）脱水与透明：染色后，再进行脱水与透 明，用浓度递增的酒精脱水： 70%→85%→95%→无水酒精（各级2~3分 钟，在95%以下浓度的酒精中伊红易脱色， 应适当缩短时间），之后用二甲苯透明 （10min2次）。
（5）封片：二甲苯透明后，将多余二甲苯擦 拭去，滴加树胶封片。封片要及时，掌握 好树胶的量。尽量做到树胶滴而不流，盖 片满而不溢，无气泡。
为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精 之后，先经过酒精二甲苯的混合液，然后再浸入 二甲苯中。无水酒精：二甲苯=1：1，15min一次； 二甲苯，15min两次。（具体时间自己摸索）
浸蜡是指透明过的组织块在融化的石蜡中浸
渍的过程，其目的是使组织内有一定的支撑物， 组织与石蜡成为不可分离的整体，使之具备一定 的硬度和韧度，便于切出满意的切片。（常用石 蜡的熔点为60~62摄氏度，如果做免疫组化，为了 保存组织内的抗原，可用48~50摄氏度的低熔点石 蜡）。
石蜡切片HE染色步骤 简约版
石蜡切片xx精－伊红（HE）染色方法
（1）选择切片：
组织尽量完整，无分裂；
（2）脱蜡：65℃烤片1h，使用二甲苯进行脱蜡，二甲苯Ⅰ-20min（二甲苯先加热到65℃，然后水浴）→二甲苯Ⅱ-15min（常温）；
（3）水化：
采用乙醇梯度水化，乙醇二甲苯-2min→无水乙醇Ⅰ-2min→无水乙醇Ⅱ-
2min→95%-2min→90%-2min→80%-2min→70%-2min→60%-2min；
（4）RO/UP水冲洗一遍（约10s）；
（5）xx精染色：
水化后的切片放入苏木精染液中浸15min，染细胞核。
RO/UP水冲洗
1min；
（6）1％盐酸乙醇分化10 s;弱碱性水溶液（5%氨水溶液）返蓝10s
（7）自来水冲洗10分钟；
（8）梯度乙醇脱水：60%-70%-80%-90%，各2min
（9）伊红染色：
充分水化后的切片直接入伊红染色液中，染细胞质1min；
（10）梯度乙醇脱水：95%→100%Ⅰ→100%Ⅱ→乙醇二甲苯—二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，各2min；
（11）中性树胶封片，65℃烤片至树胶凝固（3h以上）。
1/ 1。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤
一、石蜡切片制备
1、收集样品：根据样品的性质和形状，选择适当的采样工具和采样
容器，将样品采集到容品中并制冷处理，以防止样品发生腐败。
2、石蜡制备：在制作石蜡切片之前应先量出所需的石蜡，并将其放
入容器中，然后加入酒精等助剂加热溶解，当石蜡完全溶解熔融后，用桶
或温度控制的水浴加热，随着温度的升高，搅拌均匀，使石蜡液完全熔化，熔化后即可用于制作石蜡切片。
3、制备切片：将样品置于熔融石蜡中，用切片机将样品切成指定的
厚度，以便用于染色；将薄片分类清洗，用干净的棉棒涂上几滴石蜡，使
其连接牢固，然后放在凉爽的干燥地方。
二、HE染色
1、润湿：将样品片放入石蜡解决液，轻轻摩擦，使其充分润湿。
2、酒精消切：将石蜡解决液滴入被润湿的样品片，轻轻摇晃，完成
样品的酒精消切。
3、甲醛处理：将样品片放入含醛的苯乙酮溶液中，经摇晃后再放入95%乙醇中搅拌，使样品片可以完全吸收醛，促使样品受醛处理，使样品
片充分脱脂，加快染色效果和特殊部位的显示。
4、HE染色：将脱脂的样品片放入无菌玻璃容器内。
石蜡包埋和HE染色的制作过程
步骤一：取材与固定：取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
步骤一：脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
步骤三：浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
步骤四：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
步骤四：脱蜡常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
酒精用了2次先有低到高，再有高到低，这是为什么？步骤五：染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
————又要脱水！⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
步骤六：脱水透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
又要用一次无水酒精，这是为什么？步骤七：封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。
HE染色程序
二甲苯II
3min
15
中性树脂封片
要等树脂凝固干燥后才能放入切片盒内
16
贴标签
12
0.5%伊红染液染色
2min
13
浸水
1min
14
80%乙醇
15sec
15
90％乙醇15sec1695％乙醇15sec
17
无水乙醇I
1min
18
无水乙醇II
5min
19
二甲苯I
1min
20
二甲苯II
3min
21
中性树脂封片
要等树脂凝固干燥后才能放入切片盒内
22
贴标签
细胞涂片HE染色程序
1
浸水
1 min
常规石蜡切片HE染色程序简介
步骤
试剂
时间
1
二甲苯I
5min
2
二甲苯II
5min
3
无水乙醇
5min
4
95%乙醇
5min
5
90%乙醇
5min
6
80%乙醇
5min
7
浸水
1 min
8
苏木素液
8min
9
流动自来水洗
1 min
10
分色液：0.5%的盐酸-70%酒精溶液
数秒（3-5Sec）
11
流动自来水洗
8min
2
苏木素液
8min
3
流动自来水洗
1 min
4
分色液：0.5%的盐酸-70%酒精溶液
数秒（3-5Sec）
5
流动自来水洗
8 min
6
0.5%伊红染液染色
2min
HE染色的步骤及方法
HE染色的步骤及方法
一、技术简介
苏木精一伊红染色法(hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性和嗜酸性；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性。
细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。
而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。
脱氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋口质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
二、实验流程
1.将脱蜡至水的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
2.酸水及氨水中分色，各数秒钟。
3.流水冲洗Ih后入蒸憎水片刻。
4.70%和90%酒精中脱水各10 mine 3・酒精伊红染色液染色2-3 mine
6.染色后的切片经纯酒精脱水，再经二屮苯使切片透明。
7.将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。