应用限制性显示PCR技术构建细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库
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物工程有限公司。 接头和 P*$ 引物均由上海生物工程公司合成。组成接头 的两个寡核苷酸分 别 为 %&P： Q<=,;#*:*;*;**;,**;;;*Z
总 $’; 质量非常好。 29 :0 0F99 为 91F 2F% 的两倍， 的菌液， 得总 $’; 约 499 "@ ， E99 "@ 总 $’; 经纯 化， 可得 :$’; 约 8 "@ 。
隆了 299 多个基因片段， 已对其中 49 个片段进行了 测序鉴定，探讨了 $CUP*$ 技术在细菌 =/0> N;O 化
"0， Q9 "0 总反应体积进行 P*$ 。P*$ 反应条件： D4^ 变性 Q
然后 D4^ 39 S、 共 3Q 循环； 最后 :?J ； FQ^ 39 S、 ]8^ 2 :?J ， （[, 、 共 ]8^ 延伸 F :?J 。 4 种不同的选择性引物 [;、 [#、 [* ） 若酶切加接头连接 有 29 种不同的组合， P*$ 分成 29 组进行。 产物直接做模板， P*$ 扩 增 效 果 不 理 想 ， 可 先 用 通 用 引 物 扩 增， 再以通用引物扩增后的产物做模板， 再行选择性 P*$ 。
生
物
技
术
通
讯
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i@*2 9889
97B
文章编号 F488B>8889G9889H8I>897B>8I
研究报告
应用限制性显示 JK" 技术构建细菌 ()*+ （$） 化 !"#$ 的 DE#$ 文库
胡子有 42 马文丽 42 宋艳斌 42 张宝 42 郑文岭 9
加 $ 可发生于原初转录产物的 %& 端， 或 %& 端非翻译 区或多顺子间区的内切酶切割位点， 或在 !"#$ 部 分降解产物的编码区内’43。 细菌结构基因的表达很多 以多顺子形式表达 （在大肠杆菌基因组共有的 9 5<5 个已知和推导的操纵子中，具有两个或两个以上基 因的操纵子约占 %8:’93） ，不属于一个多顺子的基因 有时存在 =.,->0?=)@A? 现象。细菌 !"#$ 降解也无 明显方向性，可从 %& 端或 5& 端开始降解或 %& 和 5& 端同时进行’%3。 自 4BC7 年首例 DE#$ 克隆问世以来， DE#$ 文
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/0?@/ （A#）为逆转录引物 合 成 BC’;， 构 建 了 一 个 但仅对其中 F 个克隆进行了测序鉴定 L4M。 BC’; 文库， 本研究利用 =/0>N;O 与 /0?@/NA#O 特异结合的特性进行 )"*+(’ :$’; 的纯化和逆转录，并应用限制性显示 （IRSTI?BT?/J A?S=0H> P*$7 $C UP*$ ） P*$ 技 术 LQ7FM 7克
21F
$CUP*$
参考文献 LQ7FM 进 行 ， 简述如下： 将 逆 转 录 所 得 的 BC’; 约
加入 ,-$3;& 21Q "0 ， 于 89 "0 总 反 应 体 积 中 ， 2 "@ ， 3]^ 酶 切 用 #4 C’; 连 接 3 Y 。 取 酶 切 产 物 Q "0 和 制 备 的 接 头 F "0， 酶 2 "0， 39 "0 总 反 应 体 积 ， 2F^ 连 接 3 Y ， 即 可 用 作 $CU 取连接产物 2 "0， 配对的 P*$ 的模板。 8c PIR:?W .-/ 8Q "0， 浓 度 均 为 29 ":/0 _ !） 各 取 91]Q 选择性引物 （ 如 [, 和 [; ，
2 材料和方法
212
材料 大肠杆菌 V!U2 为本室保存。 溶菌酶购自上海伯 #I>=T/JR ， -RHST "WTIHBT 为 )W?/A 产品； 小量质粒提取试剂盒购 奥生物科技公司； :$’; 纯化试剂盒、 自 ):R@H (?/TRK ； 逆 转 录 酶 S6=RISBI?=T ! 购 自 !?XR #RBYJ/0/Z （A#） @?RS； C’HSR&、 /0?@/ 2E 、 )"*+(’ C’; 聚 合 酶 &、 $’HSR+、
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物
技
术
通
讯
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’/14
5607 8998
各种酶用量有所调整。 链的合成按文献 LEM进行，
21Q
接头的制备 （339 :@ _ !） 等体 取 寡 核 苷 酸 片 段 %&PNQ99 :@ _ !O 和 %&$
BC’; 文库构建方法，即使克隆成功， BC’; 文库也
收稿日期： 9889>8%>44 作者简介： 胡子有 （4BC7> ） ， 硕士 联系作者： 马文丽， X>!,1*Fb./*1g[1!!@L.-@LD/
库构建方法有了很大的改进，已成为真核分子生物 学的基本手段。但在原核生物却几乎止步不前， 由于
万方数据
8]9
细菌 :$’; 代谢快速高效，半衰期仅为几分钟， 3< 端 =/0> （;） 尾少、 短和不稳定， 使得 :$’; 的纯化和 用 /0?@/ （A#）逆转录均存在较大困难，若沿用真核
!"#$ DE#$ 文库构建中的应用价值。
关键词： DE#$ 文库；限制性显示 JK" ；细菌 中图分类号： f%I%L4c fC< 文献标识码： $
!""#$ %&’(%)*()+, -)’"#.$/012 (+ *+,’(%3*(),4 *56! #)7%.%$ +8 926! :)(; "+#$<!= (%.*(’ ), 7.*(&%).
会存在大量的冗余和重复的信息，即获得的多个大 小不同克隆可能都来自同一基因不同状态的 （A#） 与 =/0> （; ） :$’;。 2DEF 年 GHIJ?K 等利用 /0?@/ 用 特 异 结 合 的 特 性 从 !"#$%&’(’# 中 纯 化 出 :$’;，
积于一 P*$ 管内混匀，在 P*$ 仪上加热至 D9^ ，在 39 :?J 内逐渐降至室温， 形成的接头经分装后， 贮藏于 U89^ ， 备用。
（4L 第一军医大学 分子生物学研究所 2 广州 548545 ； 9L 广州军区总医院 分子肿瘤研究所，广州 548848 ） 摘要 F 针对细菌 !"#$ ()*+ （$ ） 化位点的高度多态性， 利用 )*1A) （-M） 与 ()*+ （$ ） 特异结合的特性， 以 )*1A) （-M） > 纤维
小量培养阳性菌落 后 提 按文献 LDM 进行。经快速 P*$ 鉴定后， 并编号索引。 本室 329 测序仪测序。 取质粒， C‘Q39 测定浓度，
8 812
结果 细菌的总 $’; 质量鉴定 从图 2 可见明显的 83% 、 2F%、 Q% 条带， 83% 约是
)"*+(’ C’; 连 接 酶 、 $’HSR 抑 制 剂 、 限 制 性 内 切 酶 ,-$3;&、 PIR:?W .-/ 、 =[C2EU# 载 体 、 #4 C’; 连 接 酶 等 购 自 大 连 宝 生
:$’; BC’; 文 库 构 建 中 的 应 用 价 值 7 并 展 望 了 $CUP*$ 技术在获取基因芯片制作所需的基因片段
上的优点。
21]
$CUP*$ 产物片段的克隆和测序
可直接用于与 # 载体的连接， 具体操 P*$ 产ห้องสมุดไป่ตู้无须纯化，
作参见 =[C2EU# 载体说明书。 5[29D 菌株感受态制备及转化
素 纯 化 !"#$ ， 并 以 )*1A)G-MH4< 为 引 物 逆 转 录 合 成 DE#$ ， 用 限 制 性 内 切 酶 消 化 DE#$2 所 得 的 限 制 性 内 切 酶 片 段 与 使各片段得以扩增并分布于 48 个亚组中 2 并 进 行 克 隆 ， 通用接头相连， 通过 48 个选择性引物组合进行选择性 JK" ， 化 成功地克隆了 488 多个基因片段，已对其中 I8 个进行了测序分析，探讨了限制性显示 JK" 技术在细菌 ()*+ （$ ）
现在 认 为 细 菌 !"#$ %& 端 普 遍 存 在 多 聚 腺 苷 酸 化 ’()*+,-./+*,01)/2 ()*+ （$） 但通常比真核生物 3， 的 ()*+ （$ ） 尾短得多， 一般在 45678 碱基左右， 且对 于 某 种 !"#$ 只 有 9:678: 的 分 子 被 ()*+ （$ ） 化。 真 核 生 物 !"#$ 的 ()*+ （$） 特 异 地 加 于 %& 端 而细菌 !"#$ 的 $$;$$$ 序列下游 486%8 碱基处， （$） 化无需一致的特定序列， 加 $ 位点高度多态 ()*+ 性， 在未受保护的 %& 端都可能发生 ()*+ （$ ） 化， 例如
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隆了 299 多个基因片段， 已对其中 49 个片段进行了 测序鉴定，探讨了 $CUP*$ 技术在细菌 =/0> N;O 化
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