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慢性阻塞性肺病中AQP4 mRNA的表达变化及与气道炎症的相关研究

作者：朱柏，杨岚，陈天君作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院呼吸内科，陕西西安710061

【摘要】目的探讨水通道4(apuaporin 4, AQP4)mRNA在慢性阻塞性肺病(COPD)的表达及对气道慢性炎症的影响和意义。方法选取因各种原因行支气管镜检查被病理学家证实为正常支气管黏膜者及慢性阻塞性肺病患者各30例，分别为正常组及COPD组。测试肺功能，并行支气管镜检，所取黏膜标本用逆转录PCR法检测mRNA表达，HE染色观察支气管黏膜炎症细胞浸润程度。结果与正常对照组相比较，COPD组患者支气管黏膜AQP4 mRNA表达减少(P<0.05)，并和炎症程度负相关(r=-0.493，P<0.01)，与FEV1/FVC、FEV1/pred%呈正相关(r分别为0.405、0.461，P均<0.01)。结论COPD患者水通道mRNA 表达减低，将影响气道湿化功能，加重气道炎症，促使COPD发生发展。

【关键词】慢性阻塞性肺病；水通道；气道炎症

Relationship between AQP4 mRNA expression in bronchial epithelium ofpatients with COPD and the airway inflammation

Zhu Bo, Yang Lan, Chen Tianjun

(Department of Pulmonary Disease, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xi an Jiaotong University, Xi an 710061, China)

ABSTRACT: Objective To explore the effect and significance of AQP4 mRNA expression in bronchial epithelium of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) on airway inflammation. Methods Bronchial epithelium was obtained by bronchoscopy in patients with COPD (n=30) and healthy controls (n=30) whose bronchial epithelium was confirmed to be normal by the pathologist. AQP4 mRNA were studied by RT PCR method. Inflammatory cells infiltration was observed by HE staining; pulmonary function test was performed too before bronchoscopy. Results Compared with that in the healthy controls, AQP4 mRNA expression in COPD was reduced (P<0.05). Furthermore, AQP4 mRNA expression was correlated negatively with the inflammation of bronchial epithelium (r=-0.493, P<0.01), and correlated positively with FEV1/FVC, FEV1/pred% (r was 0.405 and 0.461 respectively, P<0.01). Conclusion The reduced expression of AQP4 mRNA in bronchial epithelium of patients with COPD reduced the airway humidification, aggravated the airway inflammation, and contributed to the development of COPD.

KEY WORDS: chronic obstructive pulmonary disease; aquaporin; airway inflammation

气道水转运特性对于吸入气体的湿化和维持气道表面液层的容积和组成具有重要作用，气道表面液层的容积和组成异常在一些气道疾病如哮喘和支气管炎的发病中起重要作用。本研究检测了水通道4(aquaporin, AQP4)mRNA在慢性阻塞性肺病患者和正常支气管对照者的支气管黏膜中的表达，以探讨AQP4与气道慢性炎症的关系及在COPD发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

正常对照组选取因各种原因行支气管镜检查被病理学家证实为正常支气管黏膜者，共30例，年龄25-73岁，平均(53.33±11.51)岁。其中男性18例，女性12例。慢性阻塞性肺疾病组(COPD组)选取符合中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病学组颁布的慢性阻塞性肺疾病的诊治指南标准的COPD患者30例，年龄35-71岁，平均(55.93±12.31)岁。其中男性20例，女性10例。两组资料在年龄及性别上无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。以上两

组均不包括合并其他严重心肺疾病不能耐受气管镜检查者及合并呼吸衰竭者。

1.2 试剂

Trizol试剂购于美国sigma公司，RT PCR试剂盒、DEPC购于北京鼎国生物技术有限责任公司，DNA marker购于北京赛百盛基因技术有限公司，AQP4引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3 标本收集

各组在10g/L的卡因表面麻醉及20g/L利多卡因环甲膜穿刺麻醉后行气管镜检，钳取黏膜后一部分放于10%(体积分数)甲醛中固定，一部分放在DEPC水处理过的冻存管中，置入冰壶内运送，1h之内放在液氮中保存。

1.4 方法

1.4.1 肺功能检查

各组在平静休息5-10min后，使用德国耶格公司JAEGER肺功仪作肺功能检查，主要测量用力呼气肺活量(FVC)、1s用力呼气容积占预计值的百分比(FEV1/pred%)、1s用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)等指标。

1.4.2 形态学观察

组织块经10%(体积分数)甲醛固定后，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，切片厚度5μm，HE染色，显微镜下观察。

1.4.3 逆转录

聚合酶链反应(RT PCR)检测AQP4 mRNA表达Trizol试剂提取支气管黏膜总RNA。分光光度计测定提取的RNA浓度。取4μg总RNA进行扩增，AQP4上游引物：5′ GGAATCCTCTATCTGGTCACA 3′50pmol，下游引物：5′ TGTTTGCTGGGCAGCTTTGCT 3′50pmol，内参β actin上游引物：5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，下游5′ CTTCCTTAATGTCACGCACGA TTTC 3′，PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸45s，扩增30轮，72℃延伸加时5min。将产物在20g/L琼脂糖凝胶中电泳，扩增产物片段分别是AQP4 429bp，β actin 540bp。用图像分析系统进行定量分析。

1.5 结果判定

HE染色：炎性细胞散在分布(+)，局灶性分布( )，弥漫分布( )。PCR产物量的计算：DNA含量＝(待测标本A-背景A)/(阴性对照A-背景A)

1.6 统计学处理

所有数值资料均以均数士标准差(±s)表示。所有数据均使用SPSS 13.0统计软件处理。α＝0.05为检验水准。正常组和COPD组的AQP4 mRNA表达分析用t检验，AQP4 mRNA 表达与炎症程度、肺功能的关系用spearman计算相关系数。

2 结果

2.1 正常对照组和COPD组AQP4 mRNA的表达

COPD组AQP4 mRNA相对表达量为0.79±0.52，正常对照组AQP4 mRNA相对表达量为1.28±0.61，两组差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2 AQP4 mRNA表达与炎症程度相关性

COPD患者支气管黏膜炎症细胞浸润情况见图2。AQP4 mRNA表达与炎症程度成负相关，rs＝-0.493(P<0.01)，说明AQP4 mRNA表达上调时，炎症程度减轻，AQP4 mRNA表达下调时，支气管黏膜炎症加重。

2.3 AQP4 mRNA表达与肺功能相关性