2.8 基因治疗 PPT课件
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基因治疗PPT课件
象外科移植手术，切除病变部分，换上正 常健康基因，这在目前还难以做到
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
基因治疗(gene therapy)-95页PPT精品文档
定义 把基因转移到患者体内，使其发
挥作用，以达到治疗疾病目的的技 术称为基因治疗(Gene Therapy)。
基因治疗自Anderson于1990年进行 了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA）， 经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞， 经扩增后输回患儿体内，获得了成功。 患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳 性，除了还需应用部分剂量的ADA蛋白外， 其他体征正常。这一成功标记着基因治 疗的时代已经开始。
5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的
基因以治疗基因表达异常的疾 病。如：以野生型P53基因治疗 肺癌或急性白血病。
6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。
某些病毒或细菌产生的酶能将对人 体无毒或低毒的药物前体，在人体 细胞内一系列酶的催化下转变为细 胞毒性物质，从而导致细胞死亡。
融合法：通过原生质球相互 融合的方法，将目的基因导入靶 细胞。
2.病毒介导的基因转移 该类方法是以病毒为载体，将目
的基因导入靶细胞或器官，并使之表 达。一般在基因转移中，所使用的病 毒载体都是经过改建的有复制缺陷的 病毒。
这些病毒缺失了其自身复制所 必需的一些基因，然后将治疗基因、 一些基因的调控成分（如启动子和 增强子）以及polyA信号等插入， 使之成为表达性载体。目前在基因 转移中所使用的病毒载体有以下几 种。
3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成 员，是一类小的单链DNA病毒（基因组 约4.7kb），非常稳定。本身无致病性， 需辅助病毒（常为AV）存在时才能复 制。AAV可感染人的细胞，并能整合至 非分裂相细胞。
大部分AAV基因组可去除，从而可 使外源基因得以大量补足。AAV可以 整合进入宿主细胞基因组，但不如 RV的整合效率高。有趣的是，在感 染细胞中，野生型AAV基因组可高效 定点整合于人类第19号染色体长臂 的特定位置上，这种整合可导致染 色体基因重排，
2.8 基因治疗 PPT课件
第八节 基因治疗与基因诊断
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
• 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
• 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
《基因治疗》PPT课件
DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
基因治疗PPT课件
3
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
11
腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
23
❖ 黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗） ❖ 灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治疗）
4
基因治疗特点
❖ 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是 治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解 决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治 疗将大有作为
基因治疗
北京大学眼科中心 北京大学第三医院
1
目录
第一部分 基因治疗概述 第二部分 基因治疗载体选择 第三部分 基因治疗的发展历程 第四部分 临床基因治疗
2 2
一、基因治疗概述
❖ 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预
❖ 包括以下两方面： ➢ 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 ➢ 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变
10
❖ 反转录病毒含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位 被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提 供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。
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腺病毒（AV）
❖ 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体 存在而不整合
26
首例基因治疗死亡病例
❖ 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月 17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾 西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得 足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。
❖ 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了 基因工程技术和基因治疗的发展。
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《基因治疗》PPT课件 (2)
精品医学
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（1） 研究基因功能的新工具
由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和 有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能 丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有 力的研究工具。
RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基 因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时 间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因 敲除的效应。
能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
精品医学
2
2000年，RNA的研究进展被美国《科学》杂志评为重 大科技突破；
2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果 之一，再次入选“十大科技突破”；
2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时， Nature杂 志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。
（4）能直接作“用残于渣一”些。RNA病毒
在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基 因 治 疗 比 一 般 的 DNA 基 因 治 疗 有 更 大 的 优 势 。 利 用 反 义 RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。
精品医学
10
/RNAi.htm
将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi)。 在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥 虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化 的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功
精品医学
12
A. 贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构； RNA干扰机制示意图
精品医学
基因治疗(概述)PPT
（基四）因基治因疗增的补 策略
又称基因修饰，是指将目的基因导入病变细胞或其他 细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能会使原 有的某些功能得以加强。
在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目 前基因治疗多采用这种方式。
（五基）因基因治干疗扰的策略
又称基因失活，有两种干扰方法： 1、抑制有害的基因表达：导入肿瘤抑制基因， （如rb或 p53),以抑制癌基因的异常表达。 2、封闭有害基因：用反义RNA或小分子干扰RNA来疯币癌基 因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但可用来抑制病原体 的关键基因。
如向肿瘤细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后 给予患者无毒性的环氧鸟苷药物。肿瘤细胞被杀死，而对 正常细胞无影响。
基因治一些疗常的见策疾略病的基因治疗策略：
基因治疗
目录
1 2 3 4 5
基因治疗的发展史 基因治疗的概述 基因治疗的策略 基因治疗的方式
问题互动
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基基因因治治疗疗（g的en定e th义erapy）
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因 缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基 因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移 技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制 造的产物能治疗某种疾病。
（基三）因基治因疗激的活 策略
有些正常基因不能表达并发生了基因突变，而是由 于被错误地甲基化或编码区组蛋白去乙酰化所致；也有的 是编码区是正常的但调控区发生了突变。
前者可以通过去甲基化或乙酰化使基因恢复活性；后 者可以加入正常启动子来激活基因。
但是实现定点去甲基化和乙酰化也非易事；原位修复 调控序列也是很难的。
基因诊断：产生基因缺陷的原因除了进化障碍 因素外，主要包括点突变、缺失、插入、重排 等DNA分子畸变事件的发生。 目前已建立多种病变基因的诊断和定位方法： 如PCR扩增序列法、单链构型多态性分析法、人 类基因库搜寻法等
基因治疗.ppt
四、基因治疗的途径
第一节 基因治疗的概念及其策略
四、基因治疗的途径
1. ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因， 经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体 内，让外源基因表达以改善患者症状。
2.in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体 内表达发挥治疗作用。in vivo法比ex vivo法更简单、直 接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移 手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。
第一节 基因治疗的概念及其策略
二、基因治疗的前提条件
1、发病机制在DNA水平上已经清楚 ； 2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽 的了解 ； 3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。
第一节 基因治疗的概念及其策略
三、基因治疗的总体策略
（1）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；
第一节 基因治疗的概念及其策略
六、 基因治疗的现状与展望
1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案，腺 苷酸脱氢酶（ADA）基因对两位因ADA基因缺陷而导 致严重免疫缺损的女孩进行治疗，获得了令人满意的 结果。迄今报道已有数千例经基因治疗的患者，病种 主要是恶性肿瘤，艾滋病、肺囊性纤维化等。
第二节 基因治疗的载体
肿瘤的基因治疗
肿瘤的发生是由于某些元癌基因的激活、抑癌基因 的失活及凋亡相关基因的改变从而 导致细胞增殖分 化和凋亡失调。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外 源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正 过度活化的基因或补偿缺陷的基因，从而达到治疗 肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。
肿瘤的基因治疗
针对抑癌基因的基因治疗 针对癌基因的治疗 肿瘤免疫基因治疗
第一节 基因治疗的概念及其策略
四、基因治疗的途径
1. ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因， 经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体 内，让外源基因表达以改善患者症状。
2.in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体 内表达发挥治疗作用。in vivo法比ex vivo法更简单、直 接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移 手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。
第一节 基因治疗的概念及其策略
二、基因治疗的前提条件
1、发病机制在DNA水平上已经清楚 ； 2、要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽 的了解 ； 3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。
第一节 基因治疗的概念及其策略
三、基因治疗的总体策略
（1）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态；
第一节 基因治疗的概念及其策略
六、 基因治疗的现状与展望
1990年9月，美国批准世界上首个基因治疗方案，腺 苷酸脱氢酶（ADA）基因对两位因ADA基因缺陷而导 致严重免疫缺损的女孩进行治疗，获得了令人满意的 结果。迄今报道已有数千例经基因治疗的患者，病种 主要是恶性肿瘤，艾滋病、肺囊性纤维化等。
第二节 基因治疗的载体
肿瘤的基因治疗
肿瘤的发生是由于某些元癌基因的激活、抑癌基因 的失活及凋亡相关基因的改变从而 导致细胞增殖分 化和凋亡失调。针对肿瘤发生的遗传学背景，将外 源性目的基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正 过度活化的基因或补偿缺陷的基因，从而达到治疗 肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。
肿瘤的基因治疗
针对抑癌基因的基因治疗 针对癌基因的治疗 肿瘤免疫基因治疗
基因治疗张幻灯片优秀课件
分子诊断
遗传性疾病的诊断
羊水和胎盘绒毛膜检测
探针杂交分析法
• 用途：用于诊断已知基因突变的疾病。 • 探针：人工合成两种寡核苷酸片段，长约
16－19个单核苷酸；其中一种是正常 的，另一种含有一个突变的单核苷酸。 探针可用同位素、生物素、地高辛等标 记。 • 样本：血液或羊水细胞。
待测样品（血细胞或羊水细胞） 提取分离DNA
恢复至正常水平的 5%-10%
维持免疫系统功能
改善病人症状
•重症联合免疫缺陷的基因治疗 腺苷脱氨酶基因治疗(1990)
Ashanti de Silva, Now 13, was the first patient to be treated with gene therapy.
1991年美国科学家对50位黑色素 瘤患者进行了基因治疗，把外源的肿 瘤坏死因子（TNF）基因导入患者体 内，从而达到杀死肿瘤细胞的功能， 研究也取得了成功。
如：哮喘病遗传度为80％、精神分裂症为80 ％、高血压遗传度为62％ 、冠心病遗传度为 65％ 、糖尿病遗传度（幼年型）为75％、 （老年型）为35％、唇裂＋腭裂遗传度为76 ％
第一节
基因诊断
基因诊断
一、概念和特点 概念：利用现代分子生物学和分子遗传
学的技术方法，直接探测基因结构及其表达 水平，从而对疾病作出诊断的方法。 分为 DNA诊断和RNA诊断两类。
们自然就想到如果能够使变异基因和异常表达 的基因变成正常基因和正常表达基因，那么就 可从根本上治愈遗传疾病，这就是基因治疗的 基本思路。
基因治疗的概念：向靶细胞或组织中引入 外源DNA片段，以纠正或补偿基因的缺 陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达 到治疗的目的。
2．基因治疗的历史
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
除
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
通过从患者体内提取样本 (DNA)用基因检测方法来 判断患者是否有基因异常 或携带病原微生物的方法， 就是基因诊断。
生物技术与医药卫生
传统与基因诊断的比较
传统的诊断
–望 问 听 触——经验 –化验/检验——微生物、 免疫学、生物化学、病 理学等对细胞、组织、 酶、代谢物等检测
基因诊断
–应用分子生物学方法：如 PCR技术或PCR与分子杂交 标记 –主要应用于
基因治疗在未来人类重大疾 病的预防和治疗上必将发 挥越来越大的作用！
生物技术与医药卫生
七、基因诊断（Gene Diagnosis）
• G到T一个碱基的改变，决定了 一个人的命运
– 小皓珩出生23个月就出现皮疹、 便血等病状，患上了罕见的原发 性免疫缺陷病。 – DNA序列分析，证实了小皓珩WAS 蛋白基因的1388位核苷酸由G突 变为T，使编码谷氨酸的密码GAG 突变为终止密码TAG – WAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白， 导致患儿血小板减少，淋巴细胞 形态和功能异常 – 希望：WAS目前已经可以用骨髓 移植或干细胞移植根治
2 ．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
优点：目的基因转移到机体的所有组织并遗传给后代。
目前尚未开展，一是涉及伦理学问题；二是技术困难 （诊断困难、引起新的插入突变的危险）
1.通过回体（ex vivo）基因转移的治疗途径
（一）基因治疗的病毒载体
• I. II. 应该具有的基本条件： 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达
III.
对机体没有致病能力
病毒载体的产生
充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编
码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因、
包装容量等） 外源基因插入病毒基因组的非必须区
I. 较大的基因组使得遗传操作较难进行
II. 不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间 受限 III.包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观 察
◆痘病毒（Poxvirus, PV）载体
优点：
I. 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用
II. 外源基因的容量可达30 kb III.适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： I. 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
4.其它方法
•受体介导基因转移技术 •磷酸钙共沉淀法 •电穿孔法 •显微注射法
五、基因治疗的应用
转入功能基因（单基因遗传病）
–血友病B 薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因 子的cDNA至血友病B患者的皮肤成纤维细胞中， 再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明 显增高，症状得到改善 –重症综合性免疫缺乏症（SCID）
II. 载体过大，受免疫系统的影响也较大。
（二）非病毒载体
1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
II.包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒
优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用
缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形 式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。
四、基因转移的方法
病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 非生物学方法 直接注射 脂质体 受体介导
Fig.3. PBS (A) or control virus Ad.GFP treated animals (B), or Ad.RGD.Pk7.GFP treated animals
Fig. 4. Significant inhibition of tumor growth and bloody ascites was shown in Ad.mda-7 treated animals (C) and Ad.RGD.pK7.mda-7 treated animals(E).
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
第八节 基因治疗与基因诊断
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒 结核杆菌和疟原虫的分型
个体识别
• 公安司法系统——罪犯及受 害人的身份识别及亲子鉴定 • 部队—— 伤亡士兵的身份 识别；印尼海啸中死难人员 身份识别 • 保安—— 个人DNA身份证， 用于人员识别
14岁智障少女怀孕 亲子鉴定牵出70岁嫌犯
作业：
• “英国研究人员2007年4月12日宣布，他们在世界上首次 确认了一个与肥胖相关的等位基因，他们将之称为FTO。 这一研究成果发表在《科学》杂志上。”如果你是一名肥 胖症患者，你将如何根据这一新发现对自己进行治疗？请 简要写出治疗方案。 • “统计表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和携带者达 3.5亿人之多。我国属HBV感染高流行区。2004年中国疾 病预防控制中心对中国居民营养与健康状况调查的血样进 行乙型肝炎病毒标志物的检测表明，我国现有的慢性HBV 感染者约1.2亿人，其中慢性乙型肝炎患者约3000万例。” 请你根据所学知识，谈谈用现代生物技术对乙型肝炎的诊 断及治疗方法。
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
Fig.2. Figure showing the enhanced tumor killing effect of genetically modified Ad.RGD.pK7. mda-7 and Ad.RGD.mda-7 viruses compared to unmodified Ad.mda-7.
基因治疗SCID的过程
生物技术与医药卫生
转基因治疗的问题与危险性
• 有效的目的基因过少； • 安全性:导入的基因缺乏调 控手段； • 有效性和稳定性：缺少高效 和导向的载体系统； • 目前人们多重视分子水平的 研究而忽略了整体研究，对 整体宏观水平缺乏了解。
1999年9月17日，美 国Arizona州18岁的 青年格尔辛格在宾夕 法尼亚大学人类基因 治疗研究所接受基因 治疗4天后不幸死亡， 成为基因治疗实施以 来第1个直接死于这 种试验的病人。
Target Cell
Retrovirus/Lentivirus
Naked DNA
二、基因治疗的策略
原位修复(基因修复）：对有缺陷的基因在原来 位置上进行修复，使该基因恢复正常 基因替代疗法：治疗策略是切除发生缺陷的基 因，再转入有功能的正常 基因增强：将目的基因导入靶细胞，目的基因 的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能 基因抑制：导入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻断有害基因的表达
又称间接体内基因转移，基本途径是： I. 个体供者组织或细胞移植物 组织培养 II. 治疗基因或标记基因培养细胞 III.选择或富集转基因细胞 IV. 转染细胞实验动物或受试病人的靶器官
2. 通过体内（in vivo）基因转移的途径
又称直接体内基因转移，将插入目的基因的表达载体直接导入 体内的方法。基本途径是： I.含治疗基因表达载体直接注射 /与介质结合后直接注射或用 基因枪导入体内
六、基因治疗关键问题
1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细 胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想 的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少
Fig.1. Map of recombinant Ad.RGD.mda-7 and Ad.RGD.pK7.mda-7 adenovirus vectors genomes encoding mda-7.
• 先天遗传性疾患（苯丙酮尿 症、血红蛋白病） • 后天基因突变引起的疾病 （肿瘤、糖尿病） • 病原生物的侵入（流感、肝 炎、艾滋病） • 个体识别、法医物证
• 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因 （由辅助病毒或宿主细胞提供该基因的功能）
◆反转录病毒(Retrovirus, RV)载体
优点：基因转移的效率 高，细胞宿主范围较广 泛，DNA整合效率高于 其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态 的细胞，载体容量小（ ≤8kb），目的基因在 未分化的细胞中常丢失 ，随机整合潜在致癌的 危险。
通过从患者体内提取样本 (DNA)用基因检测方法来 判断患者是否有基因异常 或携带病原微生物的方法， 就是基因诊断。
生物技术与医药卫生
传统与基因诊断的比较
传统的诊断
–望 问 听 触——经验 –化验/检验——微生物、 免疫学、生物化学、病 理学等对细胞、组织、 酶、代谢物等检测
基因诊断
–应用分子生物学方法：如 PCR技术或PCR与分子杂交 标记 –主要应用于
基因治疗在未来人类重大疾 病的预防和治疗上必将发 挥越来越大的作用！
生物技术与医药卫生
七、基因诊断（Gene Diagnosis）
• G到T一个碱基的改变，决定了 一个人的命运
– 小皓珩出生23个月就出现皮疹、 便血等病状，患上了罕见的原发 性免疫缺陷病。 – DNA序列分析，证实了小皓珩WAS 蛋白基因的1388位核苷酸由G突 变为T，使编码谷氨酸的密码GAG 突变为终止密码TAG – WAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白， 导致患儿血小板减少，淋巴细胞 形态和功能异常 – 希望：WAS目前已经可以用骨髓 移植或干细胞移植根治
2 ．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
优点：目的基因转移到机体的所有组织并遗传给后代。
目前尚未开展，一是涉及伦理学问题；二是技术困难 （诊断困难、引起新的插入突变的危险）
1.通过回体（ex vivo）基因转移的治疗途径
（一）基因治疗的病毒载体
• I. II. 应该具有的基本条件： 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 介导外源基因的转移和表达
III.
对机体没有致病能力
病毒载体的产生
充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编
码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因、
包装容量等） 外源基因插入病毒基因组的非必须区
I. 较大的基因组使得遗传操作较难进行
II. 不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间 受限 III.包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观 察
◆痘病毒（Poxvirus, PV）载体
优点：
I. 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用
II. 外源基因的容量可达30 kb III.适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： I. 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
4.其它方法
•受体介导基因转移技术 •磷酸钙共沉淀法 •电穿孔法 •显微注射法
五、基因治疗的应用
转入功能基因（单基因遗传病）
–血友病B 薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因 子的cDNA至血友病B患者的皮肤成纤维细胞中， 再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明 显增高，症状得到改善 –重症综合性免疫缺乏症（SCID）
II. 载体过大，受免疫系统的影响也较大。
（二）非病毒载体
1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
II.包装细胞系中包装好的复制缺陷型病毒颗粒
优点：简便省时省力，能很快观察到外源基因的表达及作用
缺点：DNA在体内不易进入细胞，易被降解，以病毒颗粒的形 式导入人体则易引起免疫反应和被补体灭活。
四、基因转移的方法
病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 单纯疱疹病毒载体 非生物学方法 直接注射 脂质体 受体介导
Fig.3. PBS (A) or control virus Ad.GFP treated animals (B), or Ad.RGD.Pk7.GFP treated animals
Fig. 4. Significant inhibition of tumor growth and bloody ascites was shown in Ad.mda-7 treated animals (C) and Ad.RGD.pK7.mda-7 treated animals(E).
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被 细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 2. 3. 4. 5. 无毒性和免疫原性 可生物降解，不会在体内堆积 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可带有不同的电荷 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适 应不同的生理要求
第八节 基因治疗与基因诊断
一、基因治疗的概念
◆基因治疗（gene therapy）——就是向有功能 缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿 其基因缺陷，从而达到治疗的目的。
Gene Therapy Principles
AAV
Nucleus
Adenovirus
Therapeutic Protein
◆腺病毒(AV)载体
优点： I. 安全，不整合到染色体上 II. 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点：
I. 免疫原性较强
II. 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因 表达持续时间有限
III.插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。
◆疱疹病毒（HSV）载体
优点： I. 嗜神经组织 II. 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点：
乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒 结核杆菌和疟原虫的分型
个体识别
• 公安司法系统——罪犯及受 害人的身份识别及亲子鉴定 • 部队—— 伤亡士兵的身份 识别；印尼海啸中死难人员 身份识别 • 保安—— 个人DNA身份证， 用于人员识别
14岁智障少女怀孕 亲子鉴定牵出70岁嫌犯
作业：
• “英国研究人员2007年4月12日宣布，他们在世界上首次 确认了一个与肥胖相关的等位基因，他们将之称为FTO。 这一研究成果发表在《科学》杂志上。”如果你是一名肥 胖症患者，你将如何根据这一新发现对自己进行治疗？请 简要写出治疗方案。 • “统计表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和携带者达 3.5亿人之多。我国属HBV感染高流行区。2004年中国疾 病预防控制中心对中国居民营养与健康状况调查的血样进 行乙型肝炎病毒标志物的检测表明，我国现有的慢性HBV 感染者约1.2亿人，其中慢性乙型肝炎患者约3000万例。” 请你根据所学知识，谈谈用现代生物技术对乙型肝炎的诊 断及治疗方法。
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
Fig.2. Figure showing the enhanced tumor killing effect of genetically modified Ad.RGD.pK7. mda-7 and Ad.RGD.mda-7 viruses compared to unmodified Ad.mda-7.
基因治疗SCID的过程
生物技术与医药卫生
转基因治疗的问题与危险性
• 有效的目的基因过少； • 安全性:导入的基因缺乏调 控手段； • 有效性和稳定性：缺少高效 和导向的载体系统； • 目前人们多重视分子水平的 研究而忽略了整体研究，对 整体宏观水平缺乏了解。
1999年9月17日，美 国Arizona州18岁的 青年格尔辛格在宾夕 法尼亚大学人类基因 治疗研究所接受基因 治疗4天后不幸死亡， 成为基因治疗实施以 来第1个直接死于这 种试验的病人。
Target Cell
Retrovirus/Lentivirus
Naked DNA
二、基因治疗的策略
原位修复(基因修复）：对有缺陷的基因在原来 位置上进行修复，使该基因恢复正常 基因替代疗法：治疗策略是切除发生缺陷的基 因，再转入有功能的正常 基因增强：将目的基因导入靶细胞，目的基因 的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能 基因抑制：导入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻断有害基因的表达
又称间接体内基因转移，基本途径是： I. 个体供者组织或细胞移植物 组织培养 II. 治疗基因或标记基因培养细胞 III.选择或富集转基因细胞 IV. 转染细胞实验动物或受试病人的靶器官
2. 通过体内（in vivo）基因转移的途径
又称直接体内基因转移，将插入目的基因的表达载体直接导入 体内的方法。基本途径是： I.含治疗基因表达载体直接注射 /与介质结合后直接注射或用 基因枪导入体内
六、基因治疗关键问题
1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细 胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想 的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少
Fig.1. Map of recombinant Ad.RGD.mda-7 and Ad.RGD.pK7.mda-7 adenovirus vectors genomes encoding mda-7.
• 先天遗传性疾患（苯丙酮尿 症、血红蛋白病） • 后天基因突变引起的疾病 （肿瘤、糖尿病） • 病原生物的侵入（流感、肝 炎、艾滋病） • 个体识别、法医物证