大肠杆菌感受态细胞的制备和转__[1]...

• 转化的方法：
化学的方法(热激法)：使用化学试剂（如
CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理
将载体DNA分子导入受体细胞。
电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感 受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。
CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法， 其原理是使细菌处于0℃、 CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成
10．加入20l冰冷10%的甘油，用移液 器轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 11．立即使用或迅速置于-80º C超低温保 存。
注意事项
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生
长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞 （一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
实验试剂
１．氨苄（母液50mg/ml，终浓度为50ug/ml）：
2ml母液需氨苄100mg ２．CaCl2(终浓度20mM)：需贮液1M 、20ml，需 CaCl2固体4g ３．MgCl2(终浓度80mM)：需贮液1M 40ml，需 MgCl2固体4g ４．甘油：500ml
实验步骤
• CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 • 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤
板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长 增殖，从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
热激法转化效率为106 ～107转化子 /µg DNA。
电转化法是利用瞬间高压（10万伏/10ms） 在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤 处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应 含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA。
活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所 以称这种现象为α -互补现象。
由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释倍数×菌液总体
积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜
表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复 合物。宿主细胞一般是限制性内切酶修饰系统缺陷的变异 株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载 体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨苄青霉素的基因
（Amp＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨苄青霉素的平
5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；
6．弃去上清，加入1500l冰冷的10% 甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮； 7． 4℃下3000g冷冻离心5分钟
8．弃去上清，加入750l冰冷的10%甘 油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细 胞重新悬浮； 9． 4℃下3000g冷冻离心5分钟
合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。
• 重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有
α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分
析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。
最常用的方法是小规模制备质粒DNA进 行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还 可以结合α -互补现象来筛选。
• α-互补现象：
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必 在超净工作台和冰上操作； 4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离 来自百度文库管中，在冰上冷却10分钟；
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
1． 头一天夜接种受体菌（DH5或
DH10B），挑取单菌落于LB培养基中
37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养 基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约 2.5-3小时（250-300rpm）；
3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下
互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有
重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落
为蓝色。
重组DNA转化细菌过程示意图
重 组
DNA
转 化 细 菌 过 程 示 意 图
实验仪器
1 ．超净工作台
2 ．低温离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．-80 ℃ 冰箱 6 ．制冰机 7 ．移液器 50ul 、200ul 、1000ul
转化（transformation）：将外源DNA分子导 入细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一 种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统 缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变株。
3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的 时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达 到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca 合其他二价金属离子（如Mn
2+的基础上联
2+或Co 2+）、
DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效 率大大提高（100-1000倍）；
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄
青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；
将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较 容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基 平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个 克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混
5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂
或其它化学物质的存在可能大大降低细
菌的转化效率；
6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的
应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓 度呈正比。
计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根 据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积 ／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数 ／质粒DNA加入量(mg)
因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和N端 146个氨基酸的编码信息，编码 α-互补肽，该肽段能与宿 主编码的缺陷型β -半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。 当这种载体转入可编码β －半乳糖苷酶C端部分序列的宿主 细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导
下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶