AMRS-PCR原理

定位：专注分子诊断领域，提供卓越的产品和一流的服务 使命：提升医疗诊断水平，促进人类健康事业发展 价值：
市场向导 成就客户 优势互补 合作共赢 爱岗敬业 诚信正直 结果向导 赢在执行
核酸浓度要求：提取的标本必须≥50ng/μL，上样浓度25～50ng/ul
注：建议提取最后一步，过柱洗脱体系不少于200μL，以免存在过多的PCR抑制物 影响后续的步骤。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃保存。
二、流程与具体操作
3.加样
将已处理样本、阳性质控品 P 和 阴性质控品 P 下表加样量加入 PCR 反应管中，盖紧管盖(若出现气泡轻弹管壁至气泡消失)，2000 rpm 离心 15 秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行 PCR 扩增反应
——Boudewijn Braakhuis Professor,ESMO 2012 （欧洲肿瘤内科学会）
个体化治疗的目标是：通过对合适的人给予正确的联合用药方法，实现 以促进肿瘤生长和生存畸变为靶点的治疗。由于对潜在肿瘤恶化几只和药物 敏感性认识的增加，以及日益使用的靶向疗法和符合成本效益的多路服用实 验，因此以癌症个体化治疗作为医疗标准这一方案最终提交的时间似乎刚好。
外控
突变型
不存在的 突变型
实验室要求
• 环境要求：
•
独立，完善的分子实验室：临床基因扩增实验室应该分
为以下三个区域(试剂准备区、标本制备区、扩增区)、并且
各个区域应具备普通分子实验的基本配置。
• 人员要求：
• 操作人员应经过以下专业培训，具有合格的操作技能方能上岗。 • (a) 本产品说明书要求的操作培训。 • (b) 临床基因扩增实验室各个区域仪器设备的操作培训。 • (c) 《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》
二、流程与具体操作
具体流程：
配制PCR反应体系 核酸提取
加样 上机进行PCR反应
检测荧光信号 得出结果
二、流程与具体操作
1.配制PCR反应体系
产品组成
PCR反应液 引物探针混合液1 引物探针混合液2
...... 引物探针混合液（W）
阳性质控品P 阴性质控品P 内标质控品
试剂盒主要组成成分
主要成分
四、鑫诺美迪产品背景及应用
用于治疗的药物
目前针对EGFR的靶向药物类型有几 种，其中EGFR-TKI药物在治疗非小 细胞肺癌(NSCLC)临床疗效明显， 已被推荐为晚期患者的一线药物。 目前NSCLC患者最有效的EGFRTKI药物包括吉非替尼(Gefitinib 易瑞 沙)和厄洛替尼(Erlotinib 特罗凯)，但 并非对所有患者有效。EGFR外显子 18、19或20发生突变的患者，吉非 替尼的的有效率可高达80%，而野生 型患者基本无效。EGFR敏感突变是 药物有效的前提。
6人份规格及 装量
24人份规格及 装量
dNTP、Mg2+、Taq酶等 引物、探针 引物、探针 引物、探针 引物、探针
无生物活性基因片段 纯化水
无生物活性基因片段
600µL×1管 39 µL×1管 39 µL×1管 39µL×1管 39µL×1管 80 µL×1管 1000 µL×1管 160ul×1管
一、检测方法及原理
基本原理：
PCR扩增时在加入一对引物的 同时加入一个特异性的荧光探 针，该探针为一寡核苷酸，两 端分别标记一个报告荧光基团 和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收。但由于 Taq酶的5’端－3’端外切酶 活性将探针酶切降解，使报告 荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧 光信号。 每扩增一条DNA链，就有一个 荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全 同步
若加样后有气泡残留，可轻弹管底后再离心，以消除气泡。
二、流程与具体操作
3.加样
推荐加样与排版方式：
二、流程与具体操作
3.加样
推荐加样与排版方式：
二、流程与具体操作
3.加样
推荐加样与排版方式：Biblioteka Baidu
二、流程与具体操作
4.上机
反应条件：
注：该反应条件适用于我司所有DNA检测产品(延伸时间可能适当延长)
法规的安全防护培训。
• 仪器要求：
• 荧光定量PCR仪、高速离心机、微型离心机(带八联排转头)、 漩涡振荡器
四、鑫诺美迪产品背景及应用
• 个体化治疗基本背景：
必须强制管理假设的省文物标记应用与临床试验，但是那种“一处突变， 一种疗法”的观念可能太简单了。我们需要知道既定通路或类似通路所有可 能的基因改变情况，从而预测靶向治疗的疗效。
②确定反应数N，N=待检样本数(n)+质控品数(2)+1； 计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下：
PCR反应液 引物探针混合液 纯化水
12.5×N
6.5×N
4×N
③试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒； ④将上述混合液23 μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。
三、结果分析及解读
质量控制：
1.阴性质控品P：靶基因通道无S型扩增曲线。 2.阳性质控品P：靶基因通道有S型扩增曲线，且Ct值<30。 以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
阳性
阴性
三、结果分析及解读
结果分析：
突变结果分析：依次确定个反应管突变Ct值(CtM)和外控Ct值(CtW)，计算 △Ct值= CtM-CtW，若
鑫诺美迪ARMS PCR产品原理与应用
——肿瘤细胞突变相关基因
• 技术部
• 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
• Beijing SinoMDgene Technology CO.,LTD.
鑫诺美迪产品原理与应用
• 目录
• 一、检测方法及原理 • 二、流程与具体操作 • 三、结果分析及解读 • 四、背景及应用
二、流程与具体操作
2.核酸提取
核酸提取：推荐使用商品化的试剂盒来提取人类基因组DNA(如 QIAGEN
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat NO.56404)，提取过程请参考相应说 明书；
核酸纯度要求：提取DNA需要紫外分光光度计测定浓度，样品无蛋白或
RNA污染，OD260/OD280=1.8～2.0, OD260/OD230≥2.0；
四、鑫诺美迪产品背景及应用
肿瘤相关通路示意图
表皮生长因子受体(EGFR)是一种受 体酪氨酸蛋白激酶，其广泛分布于细 胞表面，通过受体酪氨酸蛋白激酶 →Ras→Raf→MAPK信号通路对细 胞的生长、增值和分化等生理过程发 挥重要作用。EGFR等蛋白酪氨酸激 酶功能确实或其相关信号通路中关键 因子的活性或细胞定位异常，均会引 起肿瘤、免疫缺陷及心血管疾病等发 生。EGFR信号通路重要靶标的检测 机靶向也治疗一直是国际肿瘤个体化 医疗领域关注的焦点。
1200 µL×2管 156µL×1管 156µL×1管 156µL×1管 156µL×1管 80 µL×1管 1000 µL×1管 160ul×1管
注：一种引物探针混合液检测一种或一类突变型，根据不同项目有不同数量。
二、流程与具体操作
1.配制PCR反应体系
①提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000 rpm离 心15秒待用；
二、流程与具体操作
2.核酸提取
样本要求：
用量：每例标本切5张(10µm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封 存于1.5ml EP管中； 质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为 了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色 片子一张（在显微镜下肿瘤细胞比例＞70%）；
——如何应对肿瘤个体化治疗的挑战,ESMO 2012 （欧洲肿瘤内科学会）
现在比以往任何时候都更需要合作，科学家、临床医生和患者之间的合 作，以进一步推进各种靶向疗法的发展和为肿瘤童工最有效的治疗。
Michael P.Link，MD ASCO President，2012 第48届美国临床肿瘤学会年会（ASCO 2012）主席 Michael P.Link
一、检测方法及原理
检测方法：ARMS PCR法 扩增受阻突变系统
(Amplification Refractory Mutation System,ARMS) 基本原理：
附加错配突变设计在3′端引物序列中，若出现错配则不会出现扩增，如此引 物仅仅识别突变序列，而不识别正常序列。仪器通过检测反应孔中的荧光信号， 而达到检测相关已知突变基因型的目的。