分子生物学诊断技术进展

3
4 5
8
16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
22
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
λ
Q
R
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。
18
PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火
19 引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右
PCR 循环 第三步 - 引物延伸
在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右 20
14
分子生物学技术在其它领域的应用
在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激 素、受体）的基因表达的检测； 药物基因组学、耐药基因的检测，等等
4、质谱

利用色、质谱结合PCR技术
6
分子诊断的功能及扩展



病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段
7分子诊断的功能及扩展 Nhomakorabea疾病分型及意义
例如：HPV （30/100） 高危---16，18，31，45 低危--- 6，11
l Taq
5’
R
5’
24
定量PCR与定性PCR测定的区别

定量PCR测定的是扩 增的指数扩增期;

定性PCR测定的是扩 增的终点（平台期）
25
市场上常见的实时荧光PCR仪
罗氏Lightcycler
MJ opticon2
伯乐icycler
15
简单介绍实验原理

PCR
(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)

荧光实时定量PCR （real time PCR） NASBA （依赖核酸序列的扩增）

16
PCR原理:实质就是体外基因复制技术
靶序列
靶序列引物退火55 °C
Mg
2+
dCTP dGTP dUTP dATP Primer
第1个PCR循环完成后
21
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
No. of Cycles 1 2
No. Amplicon Copies of Target 2 4
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
分子生物学诊断技术进展
张 正 北京大学人民医院
1
主要内容：

分子生物学诊断技术在病原学检测中的应用 简单介绍实验原理

以PCR、荧光实时定量PCR、NASBA为例

分子诊断技术在以下病原研究的应用进展



乙型肝炎 丙型肝炎 结核分枝杆菌
2
病原学检测常用的实验室技术

细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术
例3.
15127人 30个月
流行病学调查415对伴侣 HIV阳转22%（90/415） 51人RNA<1500copies/mL 全阴
11
分子诊断的功能及扩展

病毒载量与治疗
血浆EBV载量与鼻咽癌复发 15个二年持续缓解： 0 copy/mL 10个复发： 32250 copies/mL 17个随访：临床恶化前半年病毒载量升高
例4.
12
耐药病原的分子诊断


WHO：人类死亡1/3是长期用药的毒副作用
HBV的YMDD变异 HIV耐药
13
血制品筛查

300余万的血清阴性样品，分子生物学复测： HBV：47 HCV：10 HIV-1：2
-2001年剑桥资料

HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6%
-Am. J. Chin Athol. 2000
Taq DNA聚合酶
加热变性95 °C
AmpErase
引物延伸72 °C
17
PCR 循环 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有 适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等 的反应混合物中，在94℃下热变性1-4分钟，使之解为单链。


电镜技术

分子生物学诊断技术
3
分子生物学诊断技术方法简介
1、主体技术
循环扩增
具体方法举例
PCR （聚合酶链反应） Real-time PCR, RT-PCR，巢式PCR，复合PCR PCR-ELISA，微孔板杂交，荧光探针标记法
LCR（连接酶链反应）
恒温 NASBA（依赖核酸序列的扩增，主要用于RNA） SDA（链置换扩增术）
8
分子诊断的功能及扩展

病毒载量与治疗
例1.
---北京地坛医院谢尧提供
9
分子诊断的功能及扩展

病毒载量与治疗
HBV---干扰素 HBV<100pg/mL 11/30 阴转 HBV>100pg/mL 1/30 阴转 (HBeAg HBeAb)
例2.
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分子诊断的功能及扩展

病毒载量与治疗
HIV病毒载量与传播
23
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
Q
5’
R
3’
R Q
5’
R
Taq
3’
Extension Step
1. Strand Displacement 2. Cleavage 3. Polymerization Complete 4. Detection
3’
R
Q
5’
Taq
5’ 3’
R
Taq
5’ 5’ 3’
CPT（环状探针技术 ）
bDNA（枝链核酸信号放大系统 ） 杂交捕获 （如：检测HPV-DNA的试剂盒）
4
分子诊断技术方法简介
2、多标靶同时检测

多重PCR 毛细管电泳 以测序分析为基础的检测技术
5
分子诊断技术方法简介
3、核酸杂交



DNA荧光原位杂交（FISH） 将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再 用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来 检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位。 线性探针分析法（LiPA） 杂交保护分析法（HPA）