实验一 大肠杆菌的分离和培养
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实验一大肠杆菌的培养和分离
３.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培 养微生物吗？为什么？
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
实验1 大肠杆菌的培养和分离
B．划线上一定会出现单个突变菌株
C．此法不能除去污染的杂菌
D．划线上一定会出现细菌单菌落
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是…… …( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
2．实验原理：
使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。 在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一 个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌 操作。
到（ ）
A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落
4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )
A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌
B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液
【实验记录】 请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下 来，传给任课教师。 【结果分析】 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？
实验一大肠杆菌的分离和培养
单菌落
实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？
• 实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。
病毒
细菌
2.微生物包括五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
常用的固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,可以形成 肉眼可见的菌落.
2.培养基内所含的基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平 面。 • (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到 三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培 养12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基 的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在 37℃恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环 取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养 24h, 4℃冰箱保存。
灼菌烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
• 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
• 高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
高中生物选修一 第一部分 实验1 大肠杆菌的培养和分离
资料： 19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
实验一大肠杆菌的培养和分离
操作时右手无名指和小指 夹住封口膜，另外三指持 三角瓶，左手拿培养皿并 打开上盖的一边，在酒精 灯火焰旁操作。
.
19
（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液 体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手 无名指和小指夹住斜面的棉塞和 三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液 体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离） 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
.
11
大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
.
12
• 实验器材
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
.
21
（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。
实验一大肠杆菌的培养与分离(最新)
恒温培养箱
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床
摇床
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床 7、酒精灯和超净台
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 用途：90%以上的微生物是对人类有利的。如抗生素 多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳 由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染， 在新能源领域将发挥巨大作用。
1）放线菌
1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（1)简述甘蔗大规模快速繁殖技术的过程。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
实验1-大肠杆菌的培养与分离
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌器：1Kg/cm2， 121℃温度下维持15min 。
应用此法灭菌，一定要充分 排除灭菌器内原有的冷空气。 用于普通培养基、生理盐水、 耐热药品、手术敷料等。
手提式高压蒸汽灭菌器
（五）大肠杆菌分离后保存 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
1.在培养后如何判断是否有杂菌污染?
（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。 是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、 芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
液体培养基） 培养皿 接种环 酒精棉 酒精灯 镊子、火柴、记号笔
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配制与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划 线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
实验1：大肠杆菌的培养和分离
养基
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
大肠杆菌的培养与分离
五、大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
小结
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
三、大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
【课堂练习】 例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源
B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为 什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起 始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
FeSO4 CaCl2 H 2O
0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH 。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂） 。
高中生物选修一现代生物技术实践必背知识点
高中生物选修一《生物技术实践》必背知识点实验一大肠杆菌的培养和分离【考点一】培养基1、培养基配置①微生物的生命活动需要五大营养要素：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子；②有的物质既是碳源又是氮源（为微生物生长提供碳元素和氮元素），如：蛋白质、蛋白胨；③有的既是碳源又是生长因子（是微生物生长不可缺少的微量有机物），如：酵母提取物；④“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌喜37℃的温度；霉菌喜25-30℃的温度；⑤细菌的培养基：蛋白胨、酵母提取物、一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压；通常在中性偏碱的环境中生长；⑥霉菌的培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可；通常在中性偏酸的环境中生长；⑦在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要适宜的pH、温度以及特殊营养物质，以满足微生物生长对的要求。
2、培养基的种类及用途：①液体培养基：呈现液态，用于扩大培养和工业生产；②固体培养基：配制时需加入琼脂（凝固剂），呈固态，用于菌种分离、鉴定、计数等；③我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，用LB固体培养基来分离大肠杆菌。
【考点二】灭菌和消毒1、无菌技术：人们利用微生物完成一定的反应，必须要求某种微生物是没有被其他微生物污染的，因此，在培养微生物时必须进行无菌操作；2、灭菌是用物理或化学的方法，杀死或除去环境中的一切微生物的方法。
杀死病原菌的方法叫消毒。
如：实验室要对使用前和使用后的培养基、各种容器进行灭菌；要对实验服、对病人的排泄物和衣物进行消毒。
3、干热灭菌法：是利用火焰将接种环和试管上的微生物烧死（又称灼烧灭菌法），或在140-160℃的烘箱中加热2-3h，将微生物的营养体和芽孢杀死。
4、加压蒸气灭菌法（高压蒸气灭菌法）：这是生产和实验室常用的灭菌法，将灭菌锅内通入压力达到1000g/cm2的高压蒸气，锅内温度达121℃，持续15-30min，即可达到灭菌目的；注意：当培养基内有葡萄糖时，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。
实验一大肠杆菌培养与分离
一、基础知识: 2.关于大肠杆菌:
• 革兰氏染色：革兰氏阴性菌 • 代谢类型： 异养兼性厌氧型 • 主要分布： 肠道 • 危害： 一般无害，少数有害 • 应用：是基因工程中的主要受体菌之一
二、微生物的培养:
培养基（培养液）是由人工方法配制而成的， 专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。
•1)培养基的种类: 液体培养基：用于微生物的扩大培养
选修1需学习的实验
（微生物的利用） 实验1 大肠杆菌的培养和分离 实验2 分离以尿素为氮源的微生物
（酶的应用） 实验4 果汁中的果胶和果胶酶 实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检
测 （生物工程在食品加工中的应用） 实验8 果酒及果醋的制作实验 实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 （浅尝现代生物工程） 实验11 植物的组织培养
第一部分 :微生物的利用
实验1 大肠杆菌的培养和分离
一、基础知识
1微生物 2培养基 3无菌技术
二、实验操作
1操作步骤 2微生物的接种技术
一、基础知识:
1.关于微生物: 是一切肉眼看不见或看不清楚的微
小生物的总称．
病毒
病毒界
细菌 微生物包括 放线菌
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。
三、无菌技术
1、无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中， 所有防止杂菌污染的方法。
成功地培养微生物的关键。
从制备培养基到接种与培养等全部 实验过程要无菌操作
• （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手 进行清洁和消毒 ；
• （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器 具进行灭菌 ；
大肠杆菌微生物培养实验报告及评价标准
实验1 微生物的分离、培养及计数实验原理纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph 等）。
用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。
筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB 培养基中可以正常繁殖长成菌落。
而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB 培养基中不能繁殖。
由此可进行大肠杆菌的筛选。
梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
由此可计数计算大肠杆菌的数量。
实验目的1. 通过制备LB 固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB 平板。
2. 通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。
3. 通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。
实验材料和药品待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB 固体培养基、LB 液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP 管实验步骤（用简单的流程图表示）实验数据的记录与分析（如照片、表格等）实验结果与讨论结果：稀释了105计算出来的结果约为1.726×107ml/cm^3稀释了104计算出来的结果约为0.274×107ml/cm^3全组数据计算出来结果为2.233×107ml/cm^3讨论：在稀释倍数为104的试验中大肠杆菌菌落较少，原因可能是在稀释过程操作中，震荡不够，而且由于不小心洒了半管104稀释液，所以取液接种的时候底层的大肠杆菌数量偏少了。
也有可能是靠近酒精灯附近使得温度升高杀死了一部分细菌或者降低了活性。
大肠杆菌的培养和分离
以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再
进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后 再洗涤（特别是培养基）；使用后的废 弃物也要高压灭菌后再抛弃
5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的 大肠杆菌所污染?
转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经 过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列， 所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进 行培养。
划线分离法注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次. 2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可
五、菌种的保存
1、临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。 2、长期保存： 甘油冷冻管藏法
课后思考题
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌，
在基因工程技术中被广泛采用。
例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
实验1：大肠杆菌的培养和分离
04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落 形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色 为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化 反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌 的菌落数量，菌落数量在适宜的条件 下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆 菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独 获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离， 获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。 分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反 应等生物学特性，能够通过实验结果 判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生 的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特 性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存 等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引 起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原 和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
01
02
03
基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂 培养基等，提供大肠杆菌 生长所需的基本营养成分。
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单菌落
实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？
• 实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。
实验材料：
(1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、 NaCl 0.5g、加水50ml。 (2)大肠杆菌菌种斜面 (3)空白斜面
实验步骤
• (1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液体 培养基分别装入两个250ml • 的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。 • (2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个 培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。 • (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三 角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的 平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
细
毒
菌2.微生物包括五类源自放线菌 真 菌原生动物
(二)培养基
• • • 1.分类(按物理形态分) (1)液体培养基 (2)固体培养基
①常用的固体培养基: 琼脂固体培养基. ②微生物在固体培养基 表面生长,可以形成 肉眼可见的菌落.
2.培养基内所含的基本物质
• • • • (1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐
三、课题延伸：菌种的保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏 （长期保存）
实验1：大肠杆菌的培养和分离
设备及用品：
灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管 （15mm×120mm）5支
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
二、实验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 • 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板 • （二）分离纯化大肠杆菌 • 接种方法有： • 划线分离法和涂布分离法
• （三）将接种后的培养基和一个未接 种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并记录
（2）灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。 ② 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a.灼烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
实验1
大肠杆菌的培养和分离
实验目的：
• 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进 行细菌培养的操作。 • 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基 本进行细菌的划线培养。 • 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
一、基础知识 • (一)微生物:
1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要 用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没 有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光 合作用. 病
3.培养基内所需的其他条件 • (1)pH值 • 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱 性 • (2)特殊营养物质---- ? 生长因子 • 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生 素 • (3)氧气的含量 • 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
(三)无菌技术
• 1、获得纯净培养物的关键: 防止外来杂菌的入侵 • 2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页) • 3、消毒与灭菌 (1)消毒： ① 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢 和孢子吗？ (不包括芽孢和孢子) ② 方法: a. 煮沸消毒法 b. 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 c. 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 d. 紫外线消毒