细胞生物学研究方法

细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。

光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。

复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。

相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。

荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。

光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色

固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。

固定的方法时将样品浸泡于固定液中，是大分子交联从而保持在一定位置，常用固定液有甲醛，戊二醛。

包埋：目的是为切片做准备，增强细胞的机械支撑力，方法是将样品浸泡于介质中，使介质渗入整个样品。常用介质有石蜡，树脂。

切片：通过切片机将样品切为适合于光学显微镜观察薄片，约1~10纳米。

染色：由于细胞大部分组织都是无色透明的，因此需要通过染色给细胞不同的部分染上不同的颜色，以便于观察，常用染色剂有苏木精（碱性染料，可把染色质核糖体染成蓝紫色），伊红（酸性染料，可把细胞质，细胞外基质染成红色）等。

电子显微镜有透射电子显微镜，扫描电子显微镜，探针扫描显微镜等。

透射电子显微镜是指利用电子枪发出的高能电子束照射超薄样品，透射电子经电磁透镜多下次放大后成像的装置，其原理为样品不同部分对电子束的散射程度不同，主要用于观察样品的精细结构。透射电子显微镜样品的制备：超薄切片技术，冰冻蚀刻技术，负染色技术等。

扫描电子显微镜是指利用高能电子束扫描样品，激发样品表面产生二次电子，进而依据样品不同部位产生二次电子数量的多少而成像的装置，成像有立体感，主要用于观察样品的表面形貌。扫描电镜的样品制备：喷镀技术，二氧化碳临界点干燥法等。

探针扫描显微镜：扫描隧道显微镜（STM），原子力显微镜（AFM）

STM是指利用量子力学中的隧道效应所产生的隧道电流来扫描样品表面形貌的装置。AFM是指将探针安装于悬臂上，通过探针针尖原子与样品表面原子间弱相互作用力的变化，牵引悬臂移动，从而扫描样品表面形貌的装置。

科学研究常常需要大量的细胞。

细胞培养是指将生物组织或细胞从有机体内取出，在体外模拟其生长条件，令其继续生存并生长的技术。

原代培养：从机体取出后立即培养的细胞，将所培养10代以内的细胞统称为原代细胞。步骤：从机体中取样，剪碎→用酶或EDTA等处理，将细胞连接处消化，使细胞分散→将所得细胞匀浆至于装有配置好营养液的无菌瓶中培养，同时加入一定量小牛血清，以利于其生长和铁臂→培养瓶中分散的细胞悬浮液很快贴壁生长，称为贴壁细胞→细胞经一定贴壁便迅速铺展并有丝分裂，逐渐形成致密的细胞层，称为单层细胞。

传代培养：原代细胞在适应的体外培养条件下持续分裂的细胞。

细胞系：原代细胞培养中，度过危机继续生存下来，并保持二倍体及接触抑制的传代细胞。

研究常用的细胞系有：小鼠成纤维细胞（3T3），人上皮细胞（HeLa），经腺病毒转化的人肾细胞（293），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人胚胎干细胞系（H1,HH9）。

单克隆抗体是指将具有分泌特异性抗体能力的B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既可分泌特异性抗体，又可无限增殖。由单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群所分泌的高度纯化针对一种抗原的特异性抗体。单克隆抗体的制备：在PEG或灭活病毒的诱导下，令免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞（TK与HGPRT缺陷型）融合。融合细胞可能为B-B，瘤-瘤，瘤-B。将融合细胞在HAT培养基中培养，进行筛选。单克隆抗体技术应用广泛，如检验医学诊断试剂，蛋白质提纯，肿瘤的导向治疗，放射免疫显

像技术等。

流式细胞术是指以流式细胞仪为检测手段的一项能快速，准确的对单个细胞理化特性进行定量分析和分选的技术。特点是能够保持细胞结构与功能状态不被破坏的情况下，通过荧光分子的协助，对细胞进行定量分析，纯化分选。