果蔬汁饮料DNA提取方法的比较研究

1984年世界上第一例转基因植物延迟成熟番茄问世，1995年抗虫转基因马铃薯进入商品化生产，次年，抗虫转基因棉花和玉米也进入商品化

收稿日期：2012-08-28 *通讯作者

基金项目：北京农林科学院创新能力建设专项课题(JCX201103002)。

作者简介：任君安(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

生产，转基因农作物由此得到迅猛发展[1]。我国正在研究的转基因植物种类达几十种，涉及各类基因上百种。许多与抗虫、抗病、抗逆、产量、品

任君安1,2,3，王国兰2,3，程 曦2,3，罗 昌2,3，张秀海2,3*，任建武1*

(1.北京林业大学，北京 100083；2.农产品质量安全风险评估区域实验室(北京)，

北京 100097；3.北京农业生物技术研究中心，北京 100097)

摘要：以澄清型果蔬汁为实验材料，用3种DNA 提取方法(普通CTAB 法、试剂盒法、改良试剂盒法)提取果蔬汁中DNA 片段。以紫外分光光度计测量吸光值计算DNA 的纯度和得率，以内源rbcL 基因为目标基因建立了PCR 扩增技术体系。实验结果表明：试剂盒法和改良试剂盒法均适用于果蔬汁饮料DNA 的提取，其中改良试剂盒法提取DNA 的纯度和产率要高于另外2种方法，该方法为从果蔬汁加工品提取高质量的DNA 并进行分子检测提供技术参考。关键词：果蔬汁；DNA 提取；聚合酶链式反应

中图分类号：TS 275.5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)02-0042-04

Comparison of DNA extraction method for fruit and vegetable juices

REN Jun-an 1,2,3, WANG Guo-lan 2,3, CHENG Xi 2,3, LUO Chang 2,3, ZHANG Xiu-hai 2,3*, REN Jian-wu 1*

(1.Beijing Forestry University, Beijing 100083; 2.Regional Laboratory of Agri-product Quality and Safety Risk Appraisal, Beijing 100097; 3.Beijing Agro-Biotechnology Research

Center, Beijing 100097)

Abstract : Three kinds of DNA extraction method (CTAB, DNA extraction kit, modified DNA extraction kit) to extract genomic DNA fragment from clarified type fruit and vegetable juice. The purity and yield of the DNA were determined by A 260/A 280 respectively. The PCR amplification of partical rbcL gene fragement was set up. The results showed that both the DNA extraction kit and modified DNA extraction kit were suitable for DNA extraction from fruit and vegetable juices, the DNA purity and yield extracted with modified DNA extraction kit is higher than with the other method in this research. The research provides an effective method for DNA extraction from fruit and vegetable juices.

Key words: fruit and vegetable juices; DNA extraction; polymerase chain reaction

果蔬汁饮料DNA提取方法的

比较研究

2013年 第38卷 第2期

质和保鲜等有关基因被转入众多植物基因组中。随着转基因农作物的规模化行业种植，转基因农产品及其加工品也逐步流入了百姓餐桌，转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。为此各国对转基因产品都实行监督检测，进行标识管理，保护消费者的知情权和选择权[2]。果蔬汁是人们日常生活中常见的饮料，其产品种类繁多，有许多是混合了不同原材料加工而成，从源头上去检测是否含有转基因成分相对复杂，因此建立一套针对果蔬汁成品的检测方法是很有必要的。

目前，转基因检测的方法主要有两大类：基于蛋白质的检测方法和基于核酸的检测方法。基于核酸的检测方法应用最为广泛，因此高质量基因组DNA的提取是进行检测的基础和关键。对于植物基因组DNA的提取，通常采用幼嫩部位如嫩叶，作为实验材料[3-8]。然而，不同于直接从植物体采取的材料，果蔬汁产品经过复杂的加工工序，并且里面含有许多人工添加的各类物质以及水果果肉本身含有的多糖、多酚类物质与一些次生物质，这势必会对DNA的提取造成许多不利的影响。这就需要对常规的DNA提取方法加以改进，以提取出高质量DNA。当前国内外已有从单一水果果肉中提取总DNA进行分子检测的报道[9-12]，而对于果蔬汁的研究集中在分类、含量的测定、果汁鉴伪等方面。Chang Chai Ng [13]等用分子生物学方法鉴定了鲜榨和还原果汁，并对鲜榨橙汁的添加量进行了测定。Sass Kiss [14]等人也做了关于商业掺假西柚汁鉴别的工作，而对DNA 提取的研究则较少，本项研究以澄清型果蔬汁为研究材料，建立了高效提取DNA的方法，为转基因果蔬汁检测提供理论支持。1 材料与方法1.1 材料与试剂

牵手果蔬汁(胡萝卜、鲜橙、木瓜)：市售；RNaseA、Taq DNA聚合酶、β-巯基乙醇、DL 2000 Marker：大连(宝)生物技术有限公司；Wizard Genomic DNA purification试剂盒：普洛麦格(北京)生物技术有限公司。1.2 仪器与设备

微量离心机，电热恒温水槽，PCR仪，电泳仪及凝胶成像系统，紫外分光光度计。1.3 DNA提取方法

1.3.1 CTAB法 称取400 μL果蔬汁至一洁净

2.0 mL离心管中，加入CTAB提取液600 μL[1 mol/L Tris-HCL(pH8.0)、5 mol/L NaCl、0.5 mol/L EDTA(pH8.0)](65 ℃预热)，充分混匀，65 ℃温浴1 h，每隔5~10 min温和颠倒混匀1次；加入600 μL水饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡，于室温抽提10 min后，10000 r/min离心10 min，取上清液，再加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，震荡混匀，10000 r/min离心10 min；取上清液，加等体积异丙醇，混合均匀，-20 ℃预冷1 h后，10000 r/min离心5 min；弃去上清液，将沉淀用75%的乙醇清洗2次，干燥，溶于50 μL TE(pH8.0)溶液中，置于37 ℃溶解1 h后于-20 ℃保存备用。

1.3.2 试剂盒法 取400 μL果蔬汁至1.5 mL离心管中，加入600 μL Nuclei Lysis Solution，剧烈震荡1~3 s，65 ℃温浴15 min后，加入3 μL RNA酶，混合翻转2~5次，37 ℃温育15 min，再在室温下放置5 min，使样品冷却至室温后加200 μL蛋白沉淀液，剧烈震荡20 s，16000 g离心3 min；取上清液，加入600 μL异丙醇(室温)翻倒混匀，室温下16000 g离心1 min，弃上清液，加入600 μL乙醇(70%)，16000 g离心1 min，风干15 min后加入50 μL DNA Rehydration Solution，65 ℃温育1 h，定期混合(轻敲)。

1.3.3 改良试剂盒法 主要步骤同试剂盒法，其中，蛋白沉淀后转移至吸附柱，加入600 μL异丙醇，翻倒混匀，16000 g离心1 min，弃上清液，加70%乙醇洗涤3次，晾干，加50 μL ddH 2O，-20 ℃保存，备用。

1.4 DNA纯度和浓度的检测

用紫外分光光度计测定以上3种方法提取的DNA，由其OD 260/OD 280和浓度值判断DNA的含量和质量，每份样品重复测定3次。1.5 PCR扩增及电泳检测

为比较3种方法提取的DNA是否适合于PCR分析，采用植物内源基因rbcL基因对果蔬汁DNA进行特异性引物扩增。

引物序列分别为：rbcL：5’AA TCTTCTACTGGTACATGGAC 3’；5’TCATC ATCTTTGGTAAAATCAAG 3’片段大小为433 bp。

扩增采用25 μL反应体系，各组分组成是：DNA模板60 ng，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)2.0 μL、TaqDNA聚合酶(5