第3章 蛋白质的分离、纯化和表怔

选择变性：用加热、调节 或变性剂选 选择变性：用加热、调节pH或变性剂选 择性地变性杂蛋白。 择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细 胞色素C时 因其稳定性高，可用2.5％ 胞色素 时，因其稳定性高，可用 ％ 三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。 三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。
2.分级法 分级法 常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。 常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。 3.除盐和浓缩 除盐和浓缩 盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。 盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。 也可用分子筛， 也可用分子筛，如Saphadex G25层 层 析除盐。如样品过稀，可用反透析、 析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻 超滤等方法浓缩。 干、超滤等方法浓缩。
（一）凝胶过滤法测定相对分子质量 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对 分子质量 （三）速度沉降法测定相对分子质量
第六节 蛋白质的含量测定 和纯度鉴定
一 蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、 测定蛋白质含量的常用方法有：凯氏定氮法、 双缩脲法、 双缩脲法、Folin－酚试剂法、紫外吸收法、 －酚试剂法、紫外吸收法、 染料结合法（ 染料结合法（Bradford法）和胶体金测定 法 法等。 法等。
第3章 蛋白质的通性、纯化和 表征
第一节 蛋白质的酸碱性质
蛋白质是两性电解质，也有等电点， 蛋白质是两性电解质，也有等电点，即 等电点 所带净电荷为零的pH值 所带净电荷为零的 值。 多数蛋白等电点为中性偏酸， 左右。 多数蛋白等电点为中性偏酸，约5左右。 左右 偏酸的如胃蛋白酶，等电点为1左右 左右； 偏酸的如胃蛋白酶，等电点为 左右；偏碱 的如鱼精蛋白，约为12。 的如鱼精蛋白，约为 。 蛋白质在等电点时净电荷为零， 蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度 最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、 最小，易聚集沉淀。同时其粘度、渗透性、 膨胀性以及导电能力均为最小。 膨胀性以及导电能力均为最小。
二 蛋白质纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法， 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法， 如电泳、沉降、 和溶解度分析等。 如电泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。目 和溶解度分析等 前采用的电泳分析有等电聚焦、 前采用的电泳分析有等电聚焦、聚丙烯酰胺 凝胶电泳（ 凝胶电泳（PAGE）和SDS-PAGE、毛细管 ） 、 电泳等。 电泳等。
（一）选材及预处理 1. 选材 主要原则是原料易得，蛋白含量高。 主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋 白质的主要来源包括动物、植物和微生物。 白质的主要来源包括动物、植物和微生物。 由于种属差异及培养条件和时间的差别， 由于种属差异及培养条件和时间的差别，其 蛋白含量可相差很大。植物细胞含纤维素， 蛋白含量可相差很大。植物细胞含纤维素， 坚韧，不易破碎，且多含酚类物质， 坚韧，不易破碎，且多含酚类物质，易氧化 产生有色物质，难以除去。 产生有色物质，难以除去。其液泡中常含有 酸性代谢物，会改变溶液的pH。 酸性代谢物，会改变溶液的 。微生物因为 容易培养而常用，但也需要破碎细胞壁。 容易培养而常用，但也需要破碎细胞壁。动 物细胞易处理，但不经济。 物细胞易处理，但不经济。
第二节 蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀
(一)蛋白质是一种分子胶体，具有胶体溶液的性质。 一 蛋白质是一种分子胶体 具有胶体溶液的性质。 蛋白质是一种分子胶体， 利用半透膜可分离纯化蛋白质，称为透析 透析。 利用半透膜可分离纯化蛋白质，称为透析。 多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，易形成水 多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，易形成水 化层。一般每克蛋白可吸附0.3到0.5克水。 克水。 化层。一般每克蛋白可吸附 到 克水 分子表面的可解离基团可与周围的反离子构成稳定 双电层，增加蛋白质的稳定性。 的双电层，增加蛋白质的稳定性。 蛋白质不在等电点时具有同种电荷，互相排斥。 蛋白质不在等电点时具有同种电荷，互相排斥。因 此在等电点时易沉淀。 此在等电点时易沉淀。
蛋白质的滴定曲线形状和等电点在有 中性盐存在的情况下， 中性盐存在的情况下，可以发生明显 的变化。 的变化。观察到的等电点在一定程度 上决定于介质中的离子组成。 上决定于介质中的离子组成。 没有其他盐类存在下， 没有其他盐类存在下，蛋白质质子供 体解离出的质子与质子受体结合的质 子数相等时的pH称为等离子点。 称为等离子点 子数相等时的 称为等离子点。等离 子点对每种蛋白质是一个常数。 子点对每种蛋白质是一个常数。
蛋白质的酸碱性质，等电点， 蛋白质的酸碱性质，等电点，等离子点 蛋白质的胶体性质 根据分子大小不同的纯化方法， 根据分子大小不同的纯化方法， 利用溶 解度差别的纯化方法， 解度差别的纯化方法，利用电荷不同的 纯化方法 蛋白质稳定存在的原因及蛋白质的沉淀 方法
(二)蛋白质的沉淀 二 蛋白质的沉淀 1.盐析法 盐析法 2.有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法 3.重金属盐沉淀法 重金属盐沉淀法 4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 5.加热变性沉淀法 加热变性沉淀法
第三节 蛋白质分离纯化的 一般原则
分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可 以分为前处理、 以分为前处理、初分级分离和细分级分离三 步骤。 步。结晶是蛋白质分离纯化的最后 步骤。
（二）粗提 主要目的是除去糖、脂类、 主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂 蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法： 蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法： 1.沉淀法 沉淀法 核酸沉淀剂： 硫酸鱼精蛋白、 核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉 素、核酸酶等 蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、 蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也 等 可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂， 可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂， 以免目的蛋白变性。 以免目的蛋白变性。
（三）精制 以上方法得到的制剂可供工业应用。 以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高 纯样品，应精制。常用方法有各种层析、 纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电 等电聚焦、结晶等。 泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无 杂质，但变性蛋白不能结晶， 杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其 具有生物活性。 具有生物活性。
3.抽提 抽提 一般用缓冲液保持pH。 一般用缓冲液保持 。可溶蛋白常用稀 盐提取， 盐提取，如0.1Mol/L NaCl。脂蛋白可用稀 。 SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。 或有机溶剂抽提， 或有机溶剂抽提 不溶蛋白用稀碱处理。 抽提的原则是少量多次。 抽提的原则是少量多次。要注意防止植物细 胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和； 胞液泡中的代谢物改变 ，可加入碱中和； 为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素 。加 维生素C。 为防止酚类氧化可加 维生素 DFP或碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白 或碘乙酸可抑制蛋白酶活力， 或碘乙酸可抑制蛋白酶活力 被水解。 被水解。
2. 细胞破碎 如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎， 如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎， 使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、 使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组 织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。 织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。 植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。 植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生 物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。 物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超 声振荡、研磨、高压、溶菌酶、 声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等 方法。 方法。
第四节 蛋白质的分离纯化方法
（一） 透析和超过滤 （二） 凝胶过滤 （三） 盐溶和盐析 （四） 有机溶剂分级分离法
（五）凝胶电泳和等点聚焦 （六）离子交换层析 （七）亲和层析 （八）高效液相层析
ELECTROPHORESIS
电ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ仪
水平电泳槽
垂直电泳槽
第五节、蛋白质相对分子质量的测定 第五节、