SELEX 技术-指数富集配体的系统进化过程

核酸适配体简介

核酸适配体简介
nucleic acid oligonucleotides aptamers
适配体的类型：
★反义核苷酸链
★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与它们的靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特定靶位点的识别不够好、有一定毒性等问题,所以要对适配体中的核苷酸进行了各种各样的化学修饰。修饰位点一般在碱基、磷酸骨架等。★
寡核苷酸序列形成可与配体特异性共价结合的二级结构，配体如氨基酸、多肽、甚至金属离子都可以同随机相互作用Selex技术简介
Selex技术简介
核酸适配体的应用
随着筛选技术研究的发展,越来越多靶分子获得高亲和力的、高特异性的适配体,并广泛应用于多个研究领域,特别是分子识别检测领域。与成熟的抗体实验相比,目前适配体可以补充抗体性能的不足, 但是不能完全取代抗体。
前景展望
核酸适配体（Aptamer）是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其分子量较低（15-50碱基），没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用。
基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面开展核酸适体的研究工作： 1.首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的分析方法。而不囿于现有适体的缺乏。 2.研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳定性、增加在复杂生物体系中特异性。 3.针对应用的需要，发展更巧妙、更简便的适体分子探针；构建方便、实用的检测方法（如目视比色分析、传感分析、原位成像分析等）。 4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于生命活体分析。

SELEX技术

SELEX技术Systematic evolution of ligands by exponential enrichment 指数式富集的配体系统进化一种新的组合化学技术它是应用大容量的随机寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经几轮或数轮的筛选过程，获得高亲和力，高特异性的核酸配基。

寡核苷酸配基的特点1.靶分子广2.高特异性，高亲和力适配子的筛选：一个文库技术；一套筛选技术。

SELEX技术的基本技术路线1.体外合成一个单链寡核苷酸库。

2.把它与靶物质混合，形成靶物质-核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸。

分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，在进行下轮的筛选过程。

3.通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力，中亲和力的DNA或RNA分子被洗去。

而称之为“适配子”的，与靶物质有高亲和力的DNA或RNA分子从非常大的随机库中分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从pmol到nmol，有的甚至到umol，最后占据库的大多数（90%左右）。

4.在每轮筛选的同时，设立平行的结合力检测实验，随着筛选轮数的增加，Kd值逐渐降低，即亲和力逐渐增强。

当亲和力提高两个数量级时，将该轮的PCR产物克隆至载体，随机挑选十个克隆，测序。

影响SELEX技术的因素一．文库设计（一）文库的种类（二）两端的固定序列（三）中间的随机序列二．筛选条件（一）靶蛋白浓度（二）循环次数（三）配基的分离方法（四）SELEX技术的改进文库的种类1.随机RNA文库2.随机ssDNA文库3.化学修饰库随机单链DNA文库1.双链DNA模板变性2.生物素末端标记3.不对称PCR4.反转录法SELEX技术的改进1.导向SELEX2.基因组SELEX3.复合靶分子SELEX4.消减SELEX导向SELEX是将已知占据靶分子非目的靶位的小分子渗入SELEX筛选体系中，来获得只与目的靶位结合，高度专一的配体。

SELEX技术详解

冯俊奎单克隆抗体技术将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产单克隆抗体。

单克隆抗体单克隆抗体作为蛋白质，具有特定的空间结构，基于此空间结构其与底物结合具有特异性、多样性和定向性，使其在检验医学、蛋白质的提纯、肿瘤的导向治疗等多领域得到广泛应用。

正是由于抗体蛋白结构的多样性和特异性决定了单克隆抗体的广泛应用RNA结构的多样性RNA 分子中除G-C、A-U 碱基配对外, 还有G-U 等变偶碱基对的存在, 可以形成发夹、假结、凸环、G-四联体等空间结构, 即使一段很小的RNA 分子也能形成具有相当刚性的稳定结构。

多达1014个以上的随机寡核苷酸几乎涵盖了所有可能的立体构象, 基于核酸的三级结构，核酸配体可以高亲和力的结合于从单个小分子到复杂分子再到完整的生物细胞核组织的广泛靶目标。

SELEX 技术的诞生（1990年）Ellington 和Szostak报道了能够特异性结合于染料小分子的RNA 配体，并创造了适配体（aptamer）这个名词，以指代核酸配体。

Tuerk 和Gold描述了针对T4 DNA 聚合酶适配体的筛选，提出并命名了SELEX 技术。

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX即指数富集的配基系统进化技术利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体。

1.SELEX技术主要内容SELEX技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库,用它与靶物质混合,形成靶物质—核酸的复合物,洗掉未与靶物质结合的核酸,分离与靶物质结合的核酸,以此核酸分子为模板进行PCR扩增,再进行下轮的循环筛选过程。

通过重复的筛选与扩增,最后得到与靶物质具有高亲和力与高特异性的适体。

自1990年以来，SELEX 技术所用作的靶物质种类不断增加。

2.SELEX 的靶物质无机离子Zn2+ Ni2+有机小分子乙醇胺茶碱有机染料胆酸等核苷酸类腺嘌呤ATP cAMP 黄嘌呤等辅酶因子辅酶A 生物素FMN FAD 等核酸 E.coli5SRNA 酵母苯丙氨酸tRNA等氨基酸L-缬氨酸D-色氨酸等糖类几丁质交联葡聚糖等抗生素卡那霉素A、B 链霉素等多肽蛋白质类HIV-I整合酶HGF 链霉亲和素等复杂结构炭疽孢子核糖体蛋白PC12cell等SELEX技术对靶物质的要求SELEX可以用于众多不同的靶物质，让人们不禁想到适配子的选择可能用于所有的物质。

SELEX技术的研究进展及在医学中的应用分析

SELEX技术的研究进展及在医学中的应用分析指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of legends by exponential enrichment SELEX)是一种能获取与靶分子高选择、高亲和力结合的寡核苷酸的筛选技术,制备出的产物被称为适配体(aptam-ersDlers)。

适配体安全、无毒,具备特殊的三维结构,确保了其可与靶分子高特异性的结合,并可进一步改变靶分子的生物活性和生命进程。

适配体最大优势是没有免疫原性,并且分子量小、可化学合成、稳定性强、易于修饰和标记,与传统化学方法和免疫学方法相比,具有无可比拟的优越性。

近年来在传统SEL-EX技术基础上,各类衍生SELEX技术也被不断发展和完善,被广泛应用在生命科学研究、生物医药等领域,特别是在疾病的诊断与治疗等方面,显示出广阔的应用前景。

目前已有几种适配体诊断技术和适配体药物进入到了临床试验或临床应用阶段。

1 SELEX技术简介1. 1筛选过程SELEX技术依据分子生物学的原理,首先人工构建一个随机寡核苷酸文库,随机核苷酸序列的长度为20-40bp左右,所包含的不同种立体构象,几乎可以涵盖自然界存在的所有种类的靶分子。

将靶标物质与随机文库在一定条件下进行混合,形成文库洋巴标复合物,把未结合的核酸洗脱掉,富集与靶物质结合的核酸分子,以后者为模板进行PC R扩增,得到的产物经分离纯化后,作为进行下一轮筛选的模板。

如此反复,通过多轮(8-15轮)筛选,与靶标不结合或亲和性弱的核酸分子被充分去除,而与靶分子亲和性强的核酸分子被分离出来,同时其纯度随着筛选轮数的增加而增加。

最后筛选到的文库要经过克隆测序和特异性修饰,经过这些步骤后,所获得的特异识别靶分子的核酸才是适配体。

1.2优势和特点1)亲和力高、特异性强。

适配体与靶标之间,凭借彼此互补的三维结构,相互作用后形成牢固稳定的复合物,其解离常数通常能达到pmol/L-nmol/L的水平,并且能分辨出靶标结构上细微的差别。

SELEX技术

SELEX技术及核酸适体的介绍SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。

利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。

SELEX技术的基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，通过重复的筛选与扩增，洗去与靶物质不结合或与靶物质有高亲和力外的核酸分子，分离纯化与靶物质高度亲和的核酸适体。

SELEX技术及核酸适体具有库容量大，适应范围广泛；分辨率高，实用性强；亲和力高；筛选过程相对简便、快速、经济；适配子体积小等优势。

该技术体外诊断和体内治疗及药物的开发等方面都具有应用。

服务内容：1. 核酸适体的SELEX筛选（基于毛细管电泳技术）。

2. 适体与靶标结合及亲和力的验证。

3. 提供适体单克隆。

客户提供1. 蛋白质类靶标——可为蛋白质溶液/冻干粉/表达在细胞表面的蛋白质分子：(1) 如为蛋白质溶液提供50μg纯度>99%的蛋白质；(2) 告之蛋白质的确切名称，并附上生物或环境安全的相关信息；(3) 如为表达在细胞表面的蛋白质分子，请提表达该蛋白的细胞和空宿主细胞；由于筛选过程中需要活细胞，我们将为此种样品提供短时的细胞培养服务（收费），客户可提供可配制500ml培养基所需的材料。

2. 小分子物质靶标：(1) 提供50μg小分子与载体的偶联物（附偶联率检测报告）；(2) 告之小分子的确切名称，并附上生物或环境安全的相关信息；(3) 提供游离的小分子物质（溶液或固体，视具体物质而定）。

我们提供1. 能够与靶标结合，序列各异且亲和力（Kd）在10-8～10-10nmol/L的核酸适体单克隆若干（视最终测序结果）；2. 核酸适体亲和力检测（毛细管电泳法）结果；3. 对应核酸适体单克隆测序的峰图；4. 带有核酸适体（载体）单克隆的大肠杆菌菌液；5. 完整的实验报告（实验步骤、筛选过程中的富集率数据及相关的照片等）。

适配体的筛选技术

适配体的筛选技术——SELEX[摘要] 适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸（RNA或DNA），其可形成的特殊的立体结构如以辨识特定的蛋白质。

在一定环境下, 单链DNA 或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。

在大多数情况下, 溶液中的单链DNA 或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹( hairpin) 、假结( pseudokno t ) 、凸环( bulg e) 、G-四分体( G-quar tet ) 等特殊结构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。

这种结合不需要依靠通常的核糖磷酸骨架的亲和力, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。

这种寡核苷酸片段被称为适配体。

适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术( systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。

SELEX是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。

利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。

经过十几年的发展, SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等众多研究领域, 并且衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因组SELEX等各种子技术。

随着基因组学和蛋白质组学的深入开展, SELEX技术会有更广泛的应用前景。

[关键词]适配体；指数富集配体的系统进化; 配体;Aptamer screening technology - SELEX[Abstract] Aptamers function refers to a single-stranded antibody oligonucleotides (RNA or DNA), which can form three-dimensional structures such as special to identify specific proteins. In certain circumstances, asingle-stranded DNA or RNA can form a variety of substances with certain thermodynamically stable three-dimensional structure for a variety of functional molecules. In most cases, the solution of the single-stranded DNA or RNA conformational is uncertain, when the presence of target molecules in a suitable environment occurs adaptive single-stranded oligo folded forms a hairpin (hairpin) , fake knot (pseudokno t), convex ring (bulg e), G-tetrad (G-quar tet) and other special structure, through hydrogen bonding, hydrophobic stacking interactions, van der Waals and other closely integrated with the target molecule. This combination does not need to rely on the usual affinity ribose phosphate backbone and the target substance may be a protein, polypeptide can also be small molecules. This oligonucleotide is called aptamers. Aptamer is produced by means of ligands by exponential enrichment caused by a phylogenetic techniques (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX). SELEX was in the 1990s developed a combinatorial chemistry techniques. This technology can be single-stranded nucleic acid sequence from a random library was screened with the target substance to a specific high affinity nucleic acid ligands (ap tamer), dissociation constant of the monoclonal antibody can be comparable. After ten years of development, SELEX technology has become an important research tool, and tools are widely applied to molecular biology, genomics, clinical research and many other fields, and derived from a mixed target SELEX, in vivo SELEX, genome SELEX various sub-technologies. Withgenomics and proteomics in depth, SELEX technology has wider applications. [key words]Aptamer,SELEX,ligand20世纪90年代初, 美国科罗拉多大学(University of Col2 orado)的Tuerk 和Gold 将翻译T4 DNA 聚合酶( gp43 ) 的mRNA 中一含有8个碱基的环状结构进行序列随机化(该区域为茎环结构, 含18 个碱基, 其中环的部分有8 个碱基,gp43本身可以结合该区域并对自身合成进行调节) , 得到一个含65 536种序列的核酸库, 经过几轮筛选从中得到了两种与gp43紧密结合的核酸配体: 一种为已知的野生型, 另一种变体与野生型相差4个碱基, 两者的解离常数接近(野生型Kd = 5 ×10 - 9 mol/L, 变异性Kd = 3. 2 ×10 - 7 mol/L ) 。

核酸适体的技术

• 药物设计和临床治疗 • 由于核酸适体与蛋白特异性结合后往往能抑制蛋白的功能,而且它缺乏免疫原性,体内渗透力强,因此是一种很有发展前途的药物分子,可用于直接干扰疾病的发生发展过程。迄今筛选到的HIV、HCV、多种肿瘤及肿瘤相关因子、凝血酶、弹性蛋白酶、茶碱、氨基糖类抗生素的适体已在治疗中展示了良好的应用前景。
SELEX技术
SELEX是指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment)的简称,其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程,分别是自发突变、自然选择和大量增殖。
一“自发突变”
• 利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有10
• 此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发,荧光几乎完全被猝灭。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时,信标茎杆互补区被拉开,荧光分子和猝灭分子距离增大。杂交后,信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。
研究核酸与蛋白质的相互作用的方法 ----核酸适体技术
• 核酸适体(aptamer)指的是经体外筛选技术 SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适体在生物传感器、新药开发以及纳米技术等方面有着广泛的用途。
这一步起到达尔文进化论中自发突变的作
用。
二“自然选择”
• 单链的随机寡核苷酸序列,容易形成可与蛋白质、核酸等配体特异性共价结合的二级结构。在这一高亲和力特异性结合的基础之上,配体如进化论中的自然选择作用。

适配体的筛选技术

适配体的筛选技术——SELEX[摘要] 适配体泛指具有抗体功能的单股寡核苷酸（RNA或DNA），其可形成的特殊的立体结构如以辨识特定的蛋白质。

在一定环境下, 单链DNA 或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。

在大多数情况下, 溶液中的单链DNA 或RNA 的空间构象是不确定的, 当有目标分子存在时, 在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠, 形成发夹( hairpin) 、假结( pseudokno t ) 、凸环( bulg e) 、G-四分体( G-quar tet ) 等特殊结构, 通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合。

这种结合不需要依靠通常的核糖磷酸骨架的亲和力, 而且靶物质既可以是蛋白质, 也可以是多肽及小分子物质。

这种寡核苷酸片段被称为适配体。

适配体的产生是借由一种指数富集配体的系统进化技术( systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。

SELEX是20世纪90年代发展起来的一项组合化学技术。

利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸配体( ap tamer) , 其解离常数可以与单克隆抗体媲美。

经过十几年的发展, SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具,被广泛应用到分子生物学、基因组学、临床医学等众多研究领域, 并且衍生出了混合靶SELEX、体内SELEX、基因组SELEX等各种子技术。

随着基因组学和蛋白质组学的深入开展, SELEX技术会有更广泛的应用前景。

[关键词]适配体；指数富集配体的系统进化; 配体;Aptamer screening technology - SELEX[Abstract] Aptamers function refers to a single-stranded antibody oligonucleotides (RNA or DNA), which can form three-dimensional structures such as special to identify specific proteins. In certain circumstances, asingle-stranded DNA or RNA can form a variety of substances with certain thermodynamically stable three-dimensional structure for a variety of functional molecules. In most cases, the solution of the single-stranded DNA or RNA conformational is uncertain, when the presence of target molecules in a suitable environment occurs adaptive single-stranded oligo folded forms a hairpin (hairpin) , fake knot (pseudokno t), convex ring (bulg e), G-tetrad (G-quar tet) and other special structure, through hydrogen bonding, hydrophobic stacking interactions, van der Waals and other closely integrated with the target molecule. This combination does not need to rely on the usual affinity ribose phosphate backbone and the target substance may be a protein, polypeptide can also be small molecules. This oligonucleotide is called aptamers. Aptamer is produced by means of ligands by exponential enrichment caused by a phylogenetic techniques (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX). SELEX was in the 1990s developed a combinatorial chemistry techniques. This technology can be single-stranded nucleic acid sequence from a random library was screened with the target substance to a specific high affinity nucleic acid ligands (ap tamer), dissociation constant of the monoclonal antibody can be comparable. After ten years of development, SELEX technology has become an important research tool, and tools are widely applied to molecular biology, genomics, clinical research and many other fields, and derived from a mixed target SELEX, in vivo SELEX, genome SELEX various sub-technologies. Withgenomics and proteomics in depth, SELEX technology has wider applications. [key words]Aptamer,SELEX,ligand20世纪90年代初, 美国科罗拉多大学(University of Col2 orado)的Tuerk 和Gold 将翻译T4 DNA 聚合酶( gp43 ) 的mRNA 中一含有8个碱基的环状结构进行序列随机化(该区域为茎环结构, 含18 个碱基, 其中环的部分有8 个碱基,gp43本身可以结合该区域并对自身合成进行调节) , 得到一个含65 536种序列的核酸库, 经过几轮筛选从中得到了两种与gp43紧密结合的核酸配体: 一种为已知的野生型, 另一种变体与野生型相差4个碱基, 两者的解离常数接近(野生型Kd = 5 ×10 - 9 mol/L, 变异性Kd = 3. 2 ×10 - 7 mol/L ) 。

SELEX技术进展

甘肃医药2017年36卷第11期Gansu Medical Journal ，2017，Vol.36，No.11SELEX 技术进展Sanad Abdalbage Mohammed Abdalsadeg 1王鸣刚1袁红霞2汪靖2王进2廖世奇21.兰州理工大学，甘肃兰州730050；2.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州730050【摘要】经过几十年的发展，核酸适配体已经从基础研究进入到开发应用阶段。

核酸适配体以其特异性高和稳定性强被广泛认可。

近年来，随着核酸适配体体外筛选技术（SELEX ）的逐步改善，在核酸适配体的优化、分离、扩增以及筛选方面取得了一些成果，极大地促进了核酸适配体的开发速度。

本文对高通量新一代测序技术、生物信息学和SELEX 技术相结合的研究进展进行综述。

【关键词】SELEX ；核酸适配体；高通量测序；技术进展中图分类号：R319文献标识码：A文章编号：1004-2725（2017）11-0910-04核酸适配体作为一种新型的配基分子，具有修饰性强、易于筛选、适用范围广、特异性强等特点，被应用在疾病治疗[1-2]、靶向给药[3]、传感器[4]、诊断试剂[5]等方面。

核酸适配体是从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，通过氢键作用、范德华力和形状结构匹配等相互作用与靶分子产生高特异性的结合力，其单链能形成发夹、茎环、假节等二级结构及与配体匹配的特异性空间构象，通过这些结构能够与靶分子形成特异性强、稳定性高的复合物。

核酸适配体可以结合各种靶分子，包括：金属离子、核苷酸、ATP 、肽、氨基酸、毒素等小分子物质，及酶、生长因子、抗体、细胞黏附分子等生物大分子，甚至完整的病毒、细菌、活细胞及病理组织切片等。

通常是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponentialenrichment ，SELEX ）[6]，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，它是化学合成的，因此在体外可以自我修饰和优化。

核酸适配体在肺腺癌诊断和治疗中的应用现状及研究进展

第１８期收稿日期：２０２０－０６－１５作者简介：李名一（１９９２—），女，黑龙江鸡西人，硕士研究生，主要从事肿瘤学研究；通信作者：刘媛媛（１９７３—），女，主任医师，硕士研究生导师，主要从事肿瘤学研究。

核酸适配体在肺腺癌诊断和治疗中的应用现状及研究进展李名一１，２，姜良勇２，高　川２，刘媛媛１（１．佳木斯大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江佳木斯　１５４００４；２．佳木斯大学，黑龙江佳木斯　１５４００７）摘要：肺腺癌因其早期无特异性体征和症状，难以实现早期诊断，且由于缺乏有效的治疗手段，是目前死亡率最高的癌症之一，因此实现肺腺癌的早期诊断和有效治疗具有重大意义。

核酸适配体，它是指通过一种叫指数富集的配体系统进化技术（ＳＥＬＥＸ）筛选出来的识别靶标分子的寡核苷酸片段，它具有亲和性高、特异性高的优点，跟抗体相似。

核酸适配体因为它非常多的优点，这几年渐渐成为研究的热点。

目前发现了多个识别肺腺癌的核酸适配体，对于实现癌症的早期诊断有很大的帮助。

核酸适配体偶联药物同样也很热门，它可以提高肺腺癌治疗药物的效果，本文将会介绍核酸适配体这种技术的进展，并且在肺腺癌的早期诊断和治疗中的应用做一些具体的介绍。

关键词：核酸适配体；早期诊断；靶向治疗中图分类号：Ｒ７３０．２；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０２０）１８－００７３－０２２０世纪末，单克隆抗体（ｍＡｂ）技术的出现给医学攻克癌症带来了希望。

但是它并没有达到预期效果，之后随及出现了一种使生物分子特异性结合的技术，它就是我们现在所熟知的适配体，ａｐｔａｍｅｒ（适配体）来源于拉丁语“ａｐｔｕｓ”，意思是“西服”，希腊语后缀“ｍｅｒｏｓ”意为“部分”，这说明适配体具有与特定目标进行互动的潜力。

是最早由Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ等［１］和Ｔｕｅｒｋ等在１９９０年提出，核酸适配体是从一种人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到单链寡核苷酸，可以是单链ＤＮＡ，也可以是ＲＮＡ［２］。

Cell-SELEX技术研究进展

Cell-SELEX技术研究进展赵仲麟;李燕;袁超【摘要】适配子是通过SELEX技术,即指数富集配体系统进化技术,经反复放大筛选得到的、与目标分子有高度亲和性的分子.SELEX技术常使用纯化的靶分子,目前活细胞也可用于筛选目标,这种技术称为细胞指数富集配体系统进化技术(Cell-SELEX),其优点是产生的适配子可以与活细胞中的靶分子的天然构象发生作用.细胞表面的跨膜蛋白也可作为适配子的目标.此外,在不知道任何细胞表面分子的情况下也可以得到细胞特异性适配子.对Cell-SELEX技术的应用及研究进展进行综述.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】5页(P52-56)【关键词】Cell-SELEX;生物标记物;癌症研究;核酸;适配子【作者】赵仲麟;李燕;袁超【作者单位】河南农业大学理学院,郑州450002;郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州450002;河南农业大学理学院,郑州450002【正文语种】中文适配子是从组合核酸库中筛选到的、与靶分子具有高度亲和性的分子［1] 。

与抗体类似，适配子对目标分子具有高度亲和性和特异性。

然而适配子还有很多额外的优点，如可以抵抗还原条件和热变性等。

典型的适配子一般少于40个核苷酸，同时还要易于化学合成。

另外，适配子可以在一些生理条件下，可通过反义寡核苷酸杂交使其失活。

因此，可以用于设计解毒剂。

适配子在分子生物学和医学已经被广泛应用［2] 。

适配子通过SELEX技术，即指数富集配体系统进化技术，经反复的放大筛选得到的［3，4] 。

这个过程中，单链核酸库与靶分子孵育，单链核酸包括DNA、RNA和修饰的核酸，库由30-100个核苷酸的随机序列组成，约含1014-1015变异体。

与目标有结合活性的变异体将被回收，然后通过RT-PCR进行文库富集扩增，然后利用富集的PCR产物，通过模板链除去或体外转录重建单链库。

该过程将重复几轮至20轮不等，最终找到目标适配子。

SELEX技术及其应用进展

SELEX 技术在治疗领域的应用
在SELEX技术创立不到10年的期间内，已经筛选出大量的配基并开展了应用于临床诊断的研究。凡是涉及抗体的诊断领域，几乎都可以用核酸配基代替。抗病毒：在治疗艾滋病方面，抑制HIV-1 逆转录酶是治疗AIDS 的关键点之一. 现已运用 SELEX 技术筛选到高效结合HIV-1 反转录酶的适配子。在肝炎治疗方面，我国学者利用 SELEX技术筛选出了与丙型肝炎病毒NS3 螺旋酶特异结合的寡核苷酸适配子。抗炎：与人的p-selectin/IgG[10]和L-selectin/IgG[11]融合蛋白特异结合筛选出的适配子都已证实具有抑制融合蛋白对嗜中性粒细胞的黏附作用，且在体外试验中能彻底阻断嗜中性粒细胞在激活的血小板表面滚动.已证明能够抑制制瘤素M(OSM)与受体结合的抗体具有改善慢性关节炎症状的作用. Rhodes 等分离出了抗OSM 的核酸适配子，其治疗效果还有待证实. 而与血小板激活的生长因子，嗜中性粒细胞弹力蛋白酶，人非胰腺分泌磷酸酶 A2 特异结合筛选出的适配子都已经过动物模型证实有抗炎的效果。
抗肿瘤：在抗肿瘤方面， Santulli-Marotto[12]等筛选的细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的适配子在体外具有能抑制CTLA-4 的功能，促进小鼠体内肿瘤的衰老。抗凝血素：Ruscone 等筛选得到特异识别并能够有效抑制凝血因子Ⅸ的活性适体. Liu 等筛选出了能与牛凝血酶结合的RNA 适体。抑制血管增生：目前以分离鉴定出抗血管内皮生长因子(VEGF)的RNA 适配子pageptanib，它只与VEGF 165 及其同工型结合，抑制VEGF 结合到自身的两个磷酸激酶受体Flk-1/KDR 和Flt-1 上，使其失去活性， Pageptanib 钠盐是NX1838 的适配子，它作为治疗新生血管性老年性视网膜黄斑变性(AMD)药物的药物分子、先导分子或生物导弹来指导靶向治疗。

核酸适配体药物的研究进展

综述
生命科学仪器 2020 第18卷 / 12月刊
核酸适配体药物的研究进展
刘珊，肖楠，王睿，邓玉林，李玉娟*
（北京理工大学生命学院北京 100081）
摘要：核酸适配体（Aptamer）通常是利用指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，能够与其靶标特异性结合。核酸适配体可用作药物，核酸适配体特异性结合其靶标如蛋白质、多肽、小分子等，从而抑制其生物学功能，影响其活性，达到治疗疾病的效果。近年来，核酸适配体药物应用于眼部疾病、肿瘤、血液类疾病、心血管类疾病等诸多领域。本文对已进入临床期或上市的多种核酸适配体药物进行综述，期望为后续核酸适配体药物研发、临床试验等提供参考。关键词：核酸适配体；药物；临床试验；疾病中图分类号：R917 文献标识码：A DOI:10.11967/2020181202
1、引言
核酸适配体（Aptamer）通常是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX），从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，能够与其靶标特异性结合，图1。核酸适配体的靶标广，包括小分子、多肽、蛋白质、细胞和病毒等[1]。核酸适配体广泛应用于环境检测中，如对环境微生物、污染物、病毒、生物素等进行检测[2]。核酸适配体还可以用于食品工业，检测食品中重金属、毒素、致病菌等[3]。近年来，核酸适配体在肿瘤的
图1. SELEX筛选过程示意图 Fig. 1 Schematic of the SELEX screening process
2、核酸适配体药物 2.1 抗老年性黄斑变性（AMD）核酸适配体药物
Research Progress of Aptamer Drugs

核酸适配体

4.模拟适体分子的结构，设计和筛选小分子量的识别分子，构建可自由透过细胞膜的小分子探针，用于生命活体分析。
通过这些研究，希望开发出一系列拥有
自主知识产权的分离基质、诊断试剂和工具，以成功的应用来促进适体在生命分析应用中的发展。
适配体的类型：
★反义核苷酸链 ★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与它们的靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特定靶位点的识别不够好、有一定毒性等问题,所以要对适配体中的核苷酸进行了各种各样的化学修饰。修饰位点一般在碱基、磷酸骨架等。★
核酸适体的应用
▲基因调控方面：aptamer与配基结合后的变构效应拓展了催化性核酶的研究，使得可调控的核酶成为可能原核生物中发现的riboswitch（核糖体开关）更是aptamer参与基因表达调控的一大里程碑，该发现提示不需要蛋白质因子的参与，RNA与代谢产物结合即可调控自身的转录和翻译．根据这一原理，人工构建的riboswitch能够实现目的基因的可调控表达．利用riboswitch特性有可能发展出新型抗生素．
selex技术筛选流程寡核苷酸序列形成可与配体特异性共价结合的二级结构或rtpcr等技术进行扩增生成次一级次一级在与配体结合反复多次循环
• 其筛选流程包含和达尔文进化理论一样的三个过程分别是自发突变 ﹑自然选择和大量增殖.
SELEቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ技术筛选流程
自发突变
利用分子生物学技术人工合成一个含101
自然选择
寡核苷酸序列形成可与配体特异性共价结合的二级结构，配体如氨CR或 RT-PCR等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库在与配体结合反复多次循环。

核酸扩增新技术

核酸扩增新技术鲁雪;李赟;黄倢【摘要】核酸扩增技术广泛应用于生命科学及其相关的各个领域,对生命科学的发展发挥着重要的作用.论文对核酸扩增的一些新技术进行综述,包括环介导等温扩增(LAMP)技术,赖解旋酶恒温基因扩增(HDA)技术,固相PCR技术,指数富集配体的系统进化(SELEX)技术,SOLEXA高通量测序技术.这些新技术具有重要的应用价值,随着技术的不断完善,将会有广阔的应用前景.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)003【总页数】4页(P103-106)【关键词】LAMP技术;HDA技术;固相PCR技术;SELEX技术;SOLEXA技术【作者】鲁雪;李赟;黄倢【作者单位】中国海洋大学水产学院,山东青岛,266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛,266071;中国海洋大学水产学院,山东青岛,266003;中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛,266071【正文语种】中文【中图分类】S854.43聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是体外扩增 DNA序列的技术,它的基本原理类似于DNA的天然复制过程。

自1985年PCR技术建立以来[1],该技术不断发展,逐渐成为分子生物学、基因组学、疾病诊断等领域的基本研究手段。

PCR反应过程包括变性、退火和延伸三个阶段,因此PCR技术需要特殊的热循环仪器,耗时长(2 h～3 h)。

由于PCR技术灵敏度高,容易产生假阳性反应,并且,由于检测形式单一,结果不易判读[2]。

因此,亟需更加有效的核酸扩增方法来替代PCR技术。

目前,在聚合酶链反应这一基本原理的基础上发展出来一系列新的核酸扩增概念和实验方法,本文简要介绍了几种新的核酸扩增技术。

1 环介导等温扩增技术环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermalamp lification,LAMP)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术,可以在等温条件下一步完成。

核酸适体及其在环境检测中的应用

核酸适体及其在环境检测中的应用宋丹;杨荣;罗强;龙峰【摘要】核酸适体是通过体外筛选获得的短链DNA或RNA序列,是一种能与多种目标物质结合的生物识别分子.核酸适体具有高特异性、强稳定性及易于修饰等优势,近年来在环境检测领域得到了广泛的发展与应用.详细介绍了核酸适体的结构特点、体外筛选法及近年来在环境污染物检测中的应用情况.核酸适体可结合不同的分析技术实现重金属、有机污染物、生物毒素等环境污染物的高效灵敏检测.【期刊名称】《环境污染与防治》【年(卷),期】2018(040)006【总页数】7页(P717-722,727)【关键词】核酸适体;环境检测;重金属;污染物【作者】宋丹;杨荣;罗强;龙峰【作者单位】中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872;中国人民大学环境学院,北京100872【正文语种】中文分子生物学和基因工程的研究表明，DNA和RNA除储存和传递遗传信息外，还可通过自身结构的转变与多种类型的分子结合[1-2]。

1990年，TUERK等[3]首次运用体外筛选与聚合酶链式反应(PCR)扩增相结合的方法，从RNA随机文库中筛选出与T4噬菌体DNA特异性结合的RNA序列，并将该技术定义为指数富集配体系统进化技术(SELEX技术)。

同年，ELLINGTON等[4]通过该方法得到针对有机小分子染料的RNA序列，并命名为aptamer，源于拉丁语中“配对适合”之意。

核酸适体本质是一种短链的寡核苷酸序列，一般由几十个核苷酸组成，可以是单链DNA或RNA[5],[6]3593-3600。

核酸适体具有灵活多样的空间构象，能折叠形成发夹、假结、凸环、G-四联体等稳定的特殊结构[7-8]。

核酸适体的特殊位点能通过氢键、静电、碱基堆积等多种相互作用力特异识别靶分子，并结合形成高亲和力复合物[9-10]。

核酸适体作为生物分子识别元件，与目前应用最多的抗体相比具有诸多优势[11-13]。

适配体

Aptamers•适配体（aptamer）是指利用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链DNA和RNA分子。

筛选得到的适配体可以与DNA，RNA，蛋白质或其它靶分子结合，影响这些靶分子的性质，从而起到改变与靶分子相关的生物学功能的效果。

•1.高亲和性•2.高特异性支持RNA为生命起源的三个假说：一、如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；二、如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的"痕迹"；三、如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。

1、Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science 249:505–102、Ellington AD, Szostak JW. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346:818–221.Ellington和Szostak创造了适配体(aptamer)这个名词，以指代从SELEX技术中针对靶标系统进化出的核酸配体。

2.Tuerk和Gold描述了提出并命名了SELEX技术。

S ystematic E volution ofL igands by E xponentiale nrichment指数富集的配体系统进化技术——基本流程：1.设计并人工合成单链寡核苷酸文库2.文库与靶分子结合3.将与靶分子结合的适配子分离出来4.扩增分离出的适配子成次级文库5.再与靶分子结合进行下一次筛选6.克隆、测序适配体抗体体外体内靶分子范围极广靶分子具有免疫原性不易产生免疫反应易产生免疫反应适配体siRNA靶分子存于胞内靶分子存于胞内或胞外通过碱基互补作用多种作用力形式表现症状：痢疾、呕吐和腹部疼痛据报道10 -1000000个菌体细胞就可引起食物中毒引起的食物中毒事件的沙门氏菌前3 位依次为：肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）鸭沙门氏菌(S. anatum)沙门氏菌属属于肠杆菌科(Enterbac teriaceal)•Kaccffmamn-White Scheme 系统根据体细胞，鞭毛和荚膜抗原的差异把沙门氏菌分为不同血清群或血清型•根据发酵不同糖的能力，抗生素抵抗力，噬菌体类型和质粒特征来划分应用传统的检测方法整个过程需要48-72h利用快速检测技术与富集培养基技术（SELEX）相结合能使整个过程所需时间减少•以活的肠炎沙门氏菌作为产生分子探针的靶标，建立一个单链DNA文库。

适配体

Aptamers•适配体（aptamer）是指利用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链DNA和RNA分子。

筛选得到的适配体可以与DNA，RNA，蛋白质或其它靶分子结合，影响这些靶分子的性质，从而起到改变与靶分子相关的生物学功能的效果。

•1.高亲和性•2.高特异性支持RNA为生命起源的三个假说：一、如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；二、如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的"痕迹"；三、如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。

1、Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science 249:505–102、Ellington AD, Szostak JW. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346:818–221.Ellington和Szostak创造了适配体(aptamer)这个名词，以指代从SELEX技术中针对靶标系统进化出的核酸配体。

2.Tuerk和Gold描述了提出并命名了SELEX技术。

S ystematic E volution ofL igands by E xponentiale nrichment指数富集的配体系统进化技术——基本流程：1.设计并人工合成单链寡核苷酸文库2.文库与靶分子结合3.将与靶分子结合的适配子分离出来4.扩增分离出的适配子成次级文库5.再与靶分子结合进行下一次筛选6.克隆、测序适配体抗体体外体内靶分子范围极广靶分子具有免疫原性不易产生免疫反应易产生免疫反应适配体siRNA靶分子存于胞内靶分子存于胞内或胞外通过碱基互补作用多种作用力形式表现症状：痢疾、呕吐和腹部疼痛据报道10 -1000000个菌体细胞就可引起食物中毒引起的食物中毒事件的沙门氏菌前3 位依次为：肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）鸭沙门氏菌(S. anatum)沙门氏菌属属于肠杆菌科(Enterbac teriaceal)•Kaccffmamn-White Scheme 系统根据体细胞，鞭毛和荚膜抗原的差异把沙门氏菌分为不同血清群或血清型•根据发酵不同糖的能力，抗生素抵抗力，噬菌体类型和质粒特征来划分应用传统的检测方法整个过程需要48-72h利用快速检测技术与富集培养基技术（SELEX）相结合能使整个过程所需时间减少•以活的肠炎沙门氏菌作为产生分子探针的靶标，建立一个单链DNA文库。