primer设计原理和程序
primer引物设计知识与技巧分析大全
PCR引物设计知识与技巧分析PCR引物设计知识与技巧分析Posted on 30 五月2009 by 柳城，阅读526 简洁版繁體自从1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCP) 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。
然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物，使其有效地扩增模板DNA序列，无疑决定着PCR的成败。
现在动物遗传育种早已进入了分子时代，在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要，因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。
1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。
但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。
因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。
所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。
下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。
①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。
特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。
引物设计原理
引物设计原理概述引物设计是在分子生物学和遗传学研究中非常重要的一部分内容。
引物是用于PCR（聚合酶链式反应）、基因克隆和DNA测序等实验中的关键组成部分。
引物的设计必须精确合理，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍引物的设计原理以及一些常用的引物设计工具。
引物的定义引物是一段短的DNA或RNA序列，它们与待扩增或待测序的目标序列的两个特定位点相互作用。
在PCR反应中，引物与目标序列的两个末端结合，然后通过聚合酶的作用，在目标序列上合成新的DNA链。
在基因克隆和测序中，引物与目标序列特定区域结合，以实现目标序列的扩增或测序。
引物设计原则引物的设计需要考虑以下几个原则：1. 特异性引物应该具有高度的特异性，即只与目标序列的特定区域相互作用。
这可以通过选择具有较高GC含量的引物来实现，因为高GC含量使引物更稳定，并能够与目标序列更特异地结合。
同时，通过在引物的3’末端引入一些限制性内切酶位点，还可以进一步确保引物的特异性。
2. 避免组内和组间杂交在引物设计过程中，需要避免引物之间的互相杂交以及引物与非目标序列的互相杂交。
互相杂交可能导致非特异性扩增产物的产生，影响实验结果的准确性。
为了避免这种情况的发生，引物设计时需要借助生物信息学工具进行引物比对和引物间互相比对的分析，以确保引物之间没有相互重叠的区域。
3. 合适的长度和温度引物的长度和温度也是引物设计中需要考虑的因素。
通常，引物的长度在18-30个碱基对之间，过长或过短的引物都会导致不理想的扩增效果。
此外，引物的熔点温度（Tm）应该在50-65摄氏度之间，以保证PCR反应的成功进行。
4. 避免引物自身二聚体和非特异性扩增引物自身的二聚体和引物与非特异序列的互相作用可能会导致非特异性扩增，影响实验结果的准确性。
为了避免这种情况的发生，我们需要使用生物信息学工具进行引物序列的分析，确保引物本身不会发生相互结合以及与非特异序列发生结合的情况。
引物设计工具在引物设计中，有许多生物信息学工具可以帮助我们进行引物的选择和优化。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
《2024年利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》范文
《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言随着分子生物学技术的飞速发展，聚合酶链式反应（PCR）已成为实验室研究中不可或缺的技术之一。
PCR引物设计是PCR实验成功的关键步骤之一，它直接影响到PCR的特异性和效率。
因此，选择合适的引物设计工具对于科研工作者来说至关重要。
本文将介绍如何利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究。
二、PrimerPremier5.0软件简介PrimerPremier5.0是一款功能强大的引物设计软件，它能够根据用户提供的DNA序列信息，自动设计出合适的PCR引物。
该软件具有操作简便、引物设计效率高、特异性好等优点，广泛应用于分子生物学实验研究中。
三、PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的步骤1. 输入DNA序列信息：打开PrimerPremier5.0软件，将待设计的DNA序列信息输入到软件中。
2. 设置引物参数：根据实验需求，设置引物的长度、GC含量、退火温度等参数。
3. 设计引物：点击“Design Primers”按钮，PrimerPremier5.0将自动设计出符合要求的引物。
4. 评估引物：PrimerPremier5.0会给出每个引物的评估结果，包括引物的特异性、效率等。
用户可以根据评估结果选择合适的引物。
5. 输出引物信息：将选定的引物信息输出，以便进行后续的PCR实验。
四、PCR引物设计的注意事项1. 引物长度：一般来说，引物长度应在18-27bp之间，过短或过长的引物可能会影响PCR的特异性和效率。
2. GC含量：引物的GC含量应适中，一般建议在40%-60%之间，以避免因GC含量过高或过低而导致的PCR失败。
3. 退火温度：退火温度是PCR过程中非常重要的参数之一，它直接影响到引物的特异性和PCR的效率。
因此，在选择引物时，应尽量选择退火温度适中的引物。
4. 特异性：引物的特异性是PCR成功的关键因素之一，因此，在设计引物时，应尽量避免出现自我互补、错配等情况。
设计引物的实验报告
一、实验目的1. 掌握引物设计的原理和方法。
2. 学习利用生物信息学工具进行引物设计。
3. 了解引物在PCR实验中的应用。
二、实验原理引物是一段单链DNA或RNA，作为PCR反应的起始模板，与模板DNA链互补结合，从而在PCR反应中引导DNA的复制。
引物设计是PCR实验成功的关键因素之一。
三、实验材料1. 生物信息学工具：Primer Premier 5.0、Primer BLAST、OligoCalc等。
2. 实验样品：待扩增的DNA模板。
3. 其他：PCR试剂、DNA序列、引物合成等。
四、实验步骤1. 选择目标基因序列根据实验目的，选择合适的基因序列。
在本实验中，以某基因的cDNA序列为模板。
2. 利用生物信息学工具进行引物设计（1）打开Primer Premier 5.0软件，输入基因序列。
（2）设置引物设计参数，如：引物长度、Tm值、GC含量、引物间距离等。
（3）进行引物设计，得到多个引物序列。
（4）利用Primer BLAST和OligoCalc等工具对设计出的引物进行筛选，排除同源序列和二级结构。
3. 引物合成将筛选出的引物序列提交给引物合成公司，合成引物。
4. PCR实验（1）配制PCR反应体系，包括：引物、模板DNA、dNTPs、DNA聚合酶等。
（2）设置PCR反应程序，如：预变性、变性、退火、延伸等。
（3）进行PCR反应，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. 引物设计结果根据实验目的，设计出以下引物：上游引物：5'-ATCGTACGCTAGGCTG-3'下游引物：5'-CGTCTGACGACGTCAGT-3'2. PCR扩增结果通过PCR实验，成功扩增出目标基因片段。
六、实验结论1. 通过生物信息学工具进行引物设计，可提高引物设计的准确性和效率。
2. 合适的引物是PCR实验成功的关键，设计引物时需考虑多种因素。
3. 本实验成功设计并合成引物，为后续的PCR实验奠定了基础。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
引物设计及Primer Premier 使用介绍
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面 First you can design the primer manually
引物设计的原则
3、引物Tm
引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃ 左右。至少要在55－80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G)
引物设计的原则
4、引物3’端
• 引物3’末端和模板的碱基完全配对 • 防止一对引物内的同源性 • 考虑末端5个碱基的ΔG • 引物3′端要避开密码子的第3位
引物设计的原则
121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa
primer5.0已知基因序列,设计引物
Primer5.0 目的基因序列引物设计
GA TTtCTTGGCTTtATA TA TCTTGT GGAaAGGaCGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCAC ATATACTAGTCGACGGGTCTAGACAA TGA TGCTGGGTAA TGACACCAAGCTGGGACTG GTACAGAAAGTCAGAGAACACTTACAGAACGGCA TCTAGACAATGA TGCTGGGTAATA CACTTACAGAACGGCA TCTAGA TGCCGTTCTGTAAGTGTTTGTTGAATGAATGAGTGTT GAACAAACTGCTAAGGTATCTTT ACAAGGTAG
从中扩增出目的基因片段（绿色的部分）：
首先：将绿色部分复制到primer5.0引物设计软件中，ctrl+v用鼠标右键不管用
.选择As is后，惦记OK出现：
然后惦记，出现
图中右上角标记，其中惦记S合成的是上游引物，A是下游引物，点击S后出现，然后点击出现
这些就是上游引物，选中后ctrl+c复制到引物合成单中，发给公司，下游引物：回到
点击A出现
用前后调节框，如下，将序列向右移动移到最后，得到下图
注意显示的是3—5，ctrl+c—ctrl+v后悔发现序列变成5---3了，这是软件的好处，因为公司引物合成就是从5—3的
其实上下游引物只是相对的，将得到的引物序列填表后发给公司就好了。
引物设计步骤与要点
引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
primer premier5设计引物的原理
primer premier5设计引物的原理
Primer Premier 软件设计引物的原理主要基于以下原则：
1. 引物长度：以15-30bp为合适，最常用的是18-24bp。
2. 引物GC含量：应在40-60%之间。
3. 引物碱基分布：应遵守随机性，避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其在引物的3端不应该出现连续的G/C。
4. 避免自身互补：引物自身不能含有互补序列，否则会形成发夹一样的二级结构，影响PCR作用效果。
5. 避免引物二聚体：两个引物之间不应该有多于4个的互补/同源的碱基。
6. 引物3'端：是G/C。
7. 简并引物的出现：出于遗传密码的煎饼性。
有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。
由于大多数氨基酸（二十种常见氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，就遇到部分碱基的不确定性。
这种不确定性因物种或者细胞亚结构的不同而异。
Primer可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同DNA和氨基酸的相互转换，这取决于被分析的序列出处。
这样设计出来的引物实际上是多种序列的混合物在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。
遵循这些原则和技巧，可以帮助设计出更有效和可靠的PCR引物。
引物设计步骤与要点
引物设计步骤与要点引物（primer）是在 DNA 或 RNA 聚合酶链式反应（PCR）或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）中使用的短的 DNA 或 RNA 片段。
引物通过与目标序列的互补配对，为 PCR 或 RT-PCR 提供起始点，使得复制过程能够在目标序列上进行。
引物的设计是 PCR 或 RT-PCR 的关键步骤，影响其特异性和效率。
下面将介绍引物设计的步骤与要点。
引物设计的步骤如下：1.确定目标序列：首先要明确所需扩增的目标DNA或RNA序列。
例如，目标序列可以是特定基因的编码区域，或者是需要检测的病原体的DNA片段。
2. 引物长度：引物的长度通常在 18-30 bp 之间。
长度较长的引物可能会导致非特异性扩增，而较短的引物可能会导致不够稳定，产生非特异性扩增产物。
在设计引物时，应注意避免引物间或引物与模板间的互相互补性。
3.GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
GC含量过高可能导致引物之间的二聚体形成，而GC含量过低可能导致引物的稳定性不足。
4.特异性：引物应与目标序列的特定部分互补配对，以确保特异性扩增。
在设计引物时，通常选择序列中的保守区域作为互补匹配的区域，以确保其在各物种或基因型中的适用性。
此外，可以通过使用在线工具，如NCBIBLAST，对引物进行特异性检测，以避免与非目标序列互补匹配。
5. 引物之间的互补配对：在 PCR 扩增中，引物通常成对使用，所以引物之间不应存在互补配对，以避免二聚体形成。
另外，引物对之间的距离应合适，通常在 100-300 bp 之间。
6.引物的末端设计：引物的末端设计直接影响PCR的效率和特异性。
在设计引物时，应注意避免末端的一些特定的串扰序列，如GGGG、CCCC、AAAA、TTTT等。
此外，引物的末端可以添加一些特定的序列，如引物标记和引物序列的识别序列，以便进一步的实验操作。
引物设计的要点如下：1.使用专业软件或在线工具进行辅助设计：可以使用一些专业的引物设计软件或在线工具来辅助引物的设计。
引物设计操作-常用软件
引物设计的原理和程序一、设计原理1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。
若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。
4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。
7、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。
8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。
二、序列查找根据所需检测的待检定基因，在/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar网址查询有关序列。
三、引物设计与筛选分别以Primer Premier 5.0和Beacon Designer 5.1软件为例，进行引物设计和筛选。
（一）、Primer Premier 5.0软件1、打开软件，调入序列2、选择序列文件名，加入右框3、序列显示如图，4、点击“Primer”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“OK”进行引物搜寻5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构，依次筛选（二）、Beacon Designer 5.1软件1、打开软件，调入序列2、选择序列文件名，加入右框3、序列显示如图，4、选择引物设计方式5、点击“Primer Search（图标）”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，7、按照搜寻结果显示，逐条分析，点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选四、引物比对比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在/BLAST/ 网址进行比对1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr”2、点击“Blast”，进入下一页3、点击“Format”，进入比对结果引物和探针设计软件Primer Express操作步骤(2009-06-13 23:43:40)标签：杂谈分类：专业1. 软件登录双击Primer Express软件的图标，登录软件，显示主页面。
PCR引物设计软件primerPremier5.0应用简介
4. 引物所对应模板序列的Tm值
• 最好在72℃左右
5. ΔG值(自由能) ，
反映了引物与模板结合的 强弱程度。一般情况下，引物 的ΔG值最好呈正弦曲线形状， 即5’端和中间ΔG值较高，而3’ 端ΔG值相对较低
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不能大于38，因为过长会 导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度
2. 引物3’端的序列
引物3’端的碱基一般不用A， 因为A在错误引发位点的引发效 率相对比较高
引物间3’端的互补、二聚体 或发夹结构也可能导致PCR反应 失败
3. 引物的GC含量
一. 引物设计的基本原则
• 引物长度（primer length） • 产物长度（product length） • 序列Tm值 (melting temperature) • ΔG值(internal stabilformation and hairpin） • 错误引发位点（false priming site） • 引物及产物GC含量（composition）
Premier 的主要功能分四大块，其中有三 种功能较常用，即引物设计( )，限 制酶切点分析( )，基元查找( )。 另个功能是同源性分析（ ），并非 Premier 的特长，在此略过。该软件还有 别的一些功能，如序列”朗读”，DNA 与蛋白序列的互换（ ）
6. 引物二聚体及发夹结构的能量
一般不要超过4.5，否则 容易产生引物二聚体带而且 会降低引物浓度从而导致 PCR正常反应不能进行
二. Primer Premier 5.0 引物设计软件简介
Primer Premier 5.0用途：
Primer5使用
引物搜索选项设定
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
引物长度
28对引物
引物分值 100分为满分
搜索结果
每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross
dimer
引物编辑
引物编辑
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位 点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物 中引入该位点的点突变以作研究。
5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物 素、地高辛等）。
8. 引物的保守性与特异性
❖ 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可 能多的型别
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
❖ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 3-5℃）
❖ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上 下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤 其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致 错配。
编辑引 You
Primer Premier 5.0使用介绍
Preimer Premier 启动界面
引物设计界面
Original sequence
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
Primer+引物设计原则简介
Primer 引物设计原则简介点击次数：372 发布日期：2009-12-8 来源：北京力途科技有限公司仅供参考，谢绝转载，否则责任自负Primer 即，引物概念引物，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
类型存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。
一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。
引物设计原则引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
qPCR实验从设计primer开始到 计算方法详例
本人在日本留学虽然对于具体的原理不是特别理解，现把详细的实验real time PCR 的实验方法写出来让大家来参考。
第一步： primer 设计Primer design:1.Find out the mRNA of related gene, for example: Mus musculus transgelin(Tagln)SM22a, mRNAhttps:///nuccore/NM_011526.5NCBI> Nucleotide> GenBank2. open the website of Primer-Blasthttps:///tools/primer-blast/ 1.Enter accession, gi, or FASTANCBI Reference Sequnece:NM_011526.5 , range2.3.Write the organism that you use for mice for homo sapiens, mice: Mus musculus (taxid:10090)3.将设计的primer 序列交给公司合成就可以了。
提取mRNA1.对于组织，如血管。
在冷的PBS液体中取出血管后马上放入液氮中。
带全部样品提取完后，用粉碎机粉碎。
大概20次/秒速度， 10秒每次，3次。
2.加入1ml Trizon, 常温静止30min3.放于冰上，加入200ul chloroform，震荡混匀。
13000rpm, 4℃，离心10-15min4.取上清液，大概500-600ul5.加入500ul 2-propronaol，震荡混匀， 13000rpm, 4℃，离心10-15min。
（因小鼠组织太小，加入了4ul Dr.gene, precipitation）6.去掉液体，加入80%酒精500ul(一定要用无核酸酶的水，PCR 用水)，离心13000rpm, 4℃， 10-15min，重复操作2-3次。
dna引物的设计方法
dna引物的设计方法DNA引物的设计方法引物（primer）是DNA扩增反应中的关键组成部分，它的设计直接影响到扩增反应的效果和结果。
DNA引物的设计方法是基因组学和分子生物学研究中的重要内容之一，合理的引物设计可以提高扩增反应的特异性和敏感性。
本文将介绍几种常见的DNA引物设计方法。
1. 引物长度的选择DNA引物的长度一般在18-30个碱基对之间。
引物长度的选择要根据目标序列的长度和GC含量来确定。
过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物则会降低扩增的效率。
一般来说，引物的长度应该在20个碱基对左右。
2. 引物序列的选择引物序列的选择是DNA引物设计中的关键步骤。
引物序列应该是与目标序列互补的DNA序列。
在选择引物序列时，需要遵循以下几个原则：(1) 引物序列应该与目标序列的5'末端互补，这样可以保证引物能够与目标序列的起始位置结合;(2) 引物序列不能与非靶DNA序列互补，以避免非特异性扩增;(3) 引物序列的GC含量应在40%-60%之间，这样可以提高引物与目标序列的互补性。
3. 引物的熔解温度计算引物的熔解温度是指引物与目标序列结合的温度，它是DNA引物设计中的重要参数。
引物的熔解温度可以通过计算工具或公式来估算，一般公式为：Tm = 4(G+C) + 2(A+T)。
其中，G、C、A、T 分别代表引物中G、C、A、T的个数。
通过计算得到的熔解温度可以用来评估引物与目标序列结合的稳定性。
4. 引物的特异性检测引物的特异性是指引物只能与目标序列结合，而不能与其他非靶DNA序列结合。
为了确保引物的特异性，可以使用引物设计软件或在线工具来进行特异性检测。
这些工具可以帮助识别引物与非靶序列的互补性，以确保引物只能与目标序列结合。
5. 引物的杂交性检测引物的杂交性是指引物与目标序列的互补性。
为了检测引物的杂交性，可以使用引物设计软件或在线工具来进行杂交性分析。
这些工具可以帮助预测引物与目标序列的互补性和可能的二级结构形成。
primer引物设计教程
primer 6.0 引物设计教程首先，需要知道基因序列，如，我们要设计rat的CK18 mRNA检测的引物，我们先到这个网站查找CK18 mRNA的基因序列，首先选择Nucleotide 然后在搜索栏输入基因序列号（如果不知道基因序列号则输入rat CK18）如图然后点击搜索，就会出现rat CK18 mRNA的基因序列基因序列号现在，往下拉就会看到基因序列将这个序列复制到primer 6.0中就可以进行引物设计，我们先打开peimer 6.0破解版打开会出现这个对话框，关闭即可将序列复制至这个对话框点击新建点击Add点击这个图标出现下面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，我一般不更改，也就是引物可以设计在整个序列，你也可查一下序列有几个区，一般引物应该跨两个区。
之后点击primer Parameters这里可以设置退火温度、引物长度、产物长度等，我一般只是更改产物长度，我一般设为100到300bp，因为如果产物太大，在染料法中会影响扩增效率，之后点击Search 之后出现下面对话框点击OK 出现下面引物序列这个时候引物设计完成，我们需要对引物进行验证，我一般到NCBI （）上验证，进去后点击最下面菜单中的BLAST之后点击Primer-BLAST 点击这个图标点击这个图标将前引物复制到图中位置在这输入前引物将后引物复制（注复制前引物用Copy Sense Primer，复制后引物用Copy Anti-sence Primer 点击右键即出现复制菜单）后引物放到下图位置在这输入后引物之后将图中位置的homo sapiens 删除后输入rat出现上图对话框时选择Rattus（taxid：10114）之后点击Get Primers点这里这时会出现下图情况，因为服务器在国外，请耐心等待之后出现他能扩增很多大鼠基因，如CK18 产物为126bp，Ahsg 产物795bp，但是除了CK18 其他基因扩增是产物较大，而且有点突变，所以在PCR反应时这些东西是扩增不出来的，也就是说这个引物的特异性不错，在扩增时只会扩增出我们需要的CK18这个基因，所以这个引物我们就可以订出去，找公司合成。
primer3.0引物设计简述
primer3.0引物设计简述
Primer3.0是一种用于引物设计的计算机软件工具，它可以在
给定的DNA序列中自动设计出具有特定要求的引物。
引物设计是分子生物学实验中常用的技术步骤之一。
它通过设计合适的引物，可以在PCR扩增、DNA测序、基因克隆等实
验中起到关键作用。
引物通常是一段短的DNA序列，它们会
与目标DNA序列的两端结合，起到扩增目标DNA的作用。
Primer3.0提供了一种自动化的引物设计解决方案。
用户只需
提供目标DNA序列，然后设置一些参数，比如引物长度、引
物间的距离、GC含量等要求，Primer3.0就会根据这些要求自
动生成合适的引物序列。
使用Primer3.0进行引物设计通常包括以下几个步骤：
1. 输入目标DNA序列：用户将目标DNA序列输入Primer3.0
系统中，可以直接输入DNA序列，也可以从文件中导入。
2. 设置设计参数：用户可以设置一些参数来指导引物设计。
比如引物长度、引物间的距离、引物的温度等。
3. 进行引物设计：Primer3.0会根据用户的输入参数，在目标DNA序列中自动搜索可能的引物序列，并进行一系列计算和
评估，包括引物的长度、GC含量、互补性、二聚体形成等等。
4. 选择合适的引物：Primer3.0会根据一定的评分标准，筛选
出几个符合要求的引物序列，并提供相应的评估结果。
用户可以根据评估结果选择合适的引物。
总的来说，Primer3.0是一个实用的引物设计工具，通过自动化的引物设计过程，可以帮助用户快速、准确地设计出符合要求的引物序列，提高实验效率。
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一、設計原理 引物設計的原理和程式
1、 擇合適的靶序列：設計引物之前，必須分析待測靶序列的性質，選擇高度保守、堿 基
分佈均勻的區域進行引物設計。
2、 長度：一般來說，寡核苷酸引物長度為 15～30bp 。
3、 T m 值：引物的 T m 值一般控制在 55～60℃，盡可能保證上下游引物的 T m 值一致， 一
般不超過 2℃。
若引物中的 G+C 含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證 一定的退火溫度。
4、 （G+C ）含量：有效引物中（G+C ）的比例一般為 40～60％。
5、 堿基的隨機分佈：引物中四種堿基的分佈最好是隨機的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，
尤其在引物的 3’端不應超過 3 個連續的 G 或 C 。
6、 引物自身：引物自身不存在連續 4 個堿基以上的互補序列，如回文結構，髮夾結構
等，否則會影響到引物與範本之間的複性結合，尤其避免 3’末端的互補。
二、引物設計操作流程
序列下載
1、 序列查找 引物設計篩選
根據所需檢測的病原體或者待檢特定基因，在/pubmed 網址查詢有關序列。
2、同源性比較 主要有兩種方法 A 、 在/blast/blast.cgi 網址進行線上的兩兩比較。
B 、 採用 O MIGA, PCGENE 等軟體進行兩兩或多序列比較。
1、打開 O MIGA 軟體，導入（import ）下載存檔的純文字序列檔：
2、選擇待比較的多條序列，右鍵點擊“align sequences”命令；
3、等待電腦處理，直至狀態顯示排列結束，點擊“alignment”顯示結果；
4、“alignment”結果，相同堿基以同色標記
三、引物設計與篩選Primer Premier 5.0 軟體為例，進行引物設計和篩選的操作示範
1、打開軟體，調入序列
2、選擇路徑，選擇序列檔案名，加入右框
3、序列檔顯示如圖，點擊“primer”；
4、按照引物設計的原理，設定引物的各種參數，點擊“確定”進行引物搜尋
5、等待引物搜尋，顯示結束後，點擊“確定”，進入下一頁；
6、按照搜尋結果顯示，逐條分析，在主視窗中檢查該引物對的二級結構情況，依次篩選。