细胞外钙对HepG2细胞内钙浓度的影响_王业美

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** * **
100 60 20 2 2.25 2.5 2.75 (mmol/L)
图 2 不同细胞外钙浓度对肝细胞内钙浓度的影响 注: 与空白对照组相比, *P < 0.05, **P < 0.01
据图 2，经流式细胞仪检测，不同浓度细胞外钙作用 24 h 后，细胞内钙浓度显著升高并呈剂量效应 关系，当细胞外钙浓度为 2.75 mM 时细胞内钙荧光强度最强，为 123.25± 12.95。 2.3 不同钙通道阻断剂对细胞内钙变化的影响 据图 3，在分别给予正常钙，高钙，硝苯地平，NPS-2390，La3+后，各组细胞内钙的荧光强度值分别 为 51± 7.55,93± 10.54，87± 12.53,94± 9.64,57± 11.53；根据各组荧光值比较，给予 La3+后，显著抑制了钙内 流，而其他两种通道阻断剂并未明显阻止钙的内流，说明细胞外钙主要是通过 SOCs 内流的。
细胞外钙对 HepG2 细胞内钙浓度的影响
王业美，李松涛，李颖 （哈尔滨医科大学公共卫生学院 营养与食品卫生学教研室，哈尔滨 150086） 摘要： 目的 研究不同浓度细胞外钙对 HepG2 细胞内钙的影响并初步阐明细胞内钙变化的机制。方 法 给予不同浓度钙培养液作用 24 h 后，用 Fluo-3/AM 染色剂对 HepG2 细胞进行染色，应用流式细胞仪 检测其细胞内钙浓度的变化；利用阻断剂对钙通道进行阻断，寻找细胞内钙变化的原因；应用 siRNA 干 扰对找寻到的钙通道进行沉默，进一步确认引起钙变化的钙通道。结果 细胞内钙浓度随细胞外钙浓度的 升高而升高，当细胞外钙浓度为 2.75mmol/L 时，细胞内钙钙荧光强度值达到最大为 123.25± 12.95；钙池 操纵的钙通道（SOC）阻断剂—La3+可显著抑制外钙引起的内钙升高（P﹤0.01） ；应用 siRNA 沉默 TRPC1 通道后可显著抑制外钙引起的内钙变化。 结论 随细胞外钙浓度升高， 肝细胞内钙浓度显著增高；TRPC1 参与的钙池操纵的钙通道可能是引起细胞内钙离子升高的主要通道。 关键词：钙浓度，HepG2 细胞，钙通道，流式细胞仪 中图分类号: R735.7 文献标识码: A 文章编号: 201111004
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（5 µ M） 37℃， 5% CO2 黑暗中孵育 40 min， 弃染色液， PBS 清洗至染色液洗净， 用 D-Hank’s(137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.4 mM KH2PO4, 0.8 mM Na2HPO4, 0.8 mM MgSO4, 4.2 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 5.5 mM D-glucose, pH 7.4)液 37℃孵育 30min。 1.2.4 不同钙通道阻断剂对细胞内钙变化的影响 细胞接种于 6 孔板，待细胞达 70-80%融合分别给予电压依赖型钙通道（VDCs）阻断剂硝苯地平(10 µ M)1 h，受体操纵的钙通道（ROCs）阻断剂 NPS-2390(10 µ M)30 min，钙池操纵的钙通道（SOCs）阻断 剂 La3+(2 µ M)30 min，然后给予各组高钙溶液使细胞外钙浓度达 2.75 mmol/L（对照组除外） ，继续培养 24 h 后，应用流式细胞仪检测细胞内钙。 1.2.5 TRPC1 钙通道对细胞内钙变化的影响 细胞接种于 6 孔板，待细胞达 30-40%融合后，应用脂质 2000 转染试剂将 TRPC1 特异性 siRNA 转染 进细胞， 另外两组作为对照组用非特异性的 siRNA 进行转染， 转染方法按试剂说明进行。 转染 12 h 之后， 其中高钙组和 TRPC1 组均给予外钙浓度为 2.75 mmol/L 培养液孵育 24 h，流式细胞仪检测。 1.2.6 统计分析 采用 SPSS19.0 软件，对各组数据进行方差分析，分析差异显著性，*代表 P0.05，**代表 P0.01。 2 结果 2.1 细胞毒性实验
据图 1，HepG2 细胞在不同浓度细胞外钙作用 48 h 后，经 MTT 比色法检测，细胞外钙浓度 3 mmol∕L 以下对细胞没有毒性。因此我们选取 3 mmol∕L 以下的细胞外钙浓度作为干预浓度。 2.2 不同浓度细胞外钙作用于 HepG2 细胞后细胞内钙的变化
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HepG2细胞内钙荧光强度
The Effect of Different Concentrations of Extracelluar Ca2+ on Intracelluar Ca2+ in HepG2 Cells
Wang Yemei, Li Songtao, Li Ying ,Li Ying Department of nutrition and food hygiene, College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin Heilongjiang China, 150086 Abstract: Objective To investigate the effect of different concentrations of extracelluar calcium ([Ca 2+]ex) on intracelluar calcium([Ca2+]in) and to clarify the mechanism for the changes of [Ca 2+]in in HepG2 cells. Methods HepG2 cells were cultured in different concentrations of [Ca 2+]ex for 24 hours. After staining with Fluo-3/AM, changes of [Ca2+]in were detected by flow cytometry. Ca2+ channel blockers were used to find reasons for the changes in [Ca2+]in. siRNA were used to silence TRPC1 Ca2+ channels. Results [Ca2+]in was increased according to the increase of [Ca 2+]ex in a dose-dependent manner. While the [Ca2+]ex was 2.75 mmol/L, [Ca2+]in reached to the maximum level of 123.25 ± 12.95. La 3+, a store-operated Ca2+ channels (SOCs) blocker, significantly inhibited [Ca2+]ex influx in HepG2 cells(P﹤0.01). And when the TRPC1 was silenced by siRNA， the increase of [Ca2+]in was inhibited significantly. Conclusion Higher concentrations of [Ca2+]ex significantly increased [Ca2+]in in HepG2 cells. TRPC1 comprised SOCs was involved in the increase of [Ca 2+]in. Key words: concentrations of calcium ion; HepG2 cells; calcium channel; flow cytometry 引言 钙离子是细胞信号转导的重要信使，在体内代谢中发挥着非常重要的作用。研究表明，血钙浓度的 波动可引起兴奋性细胞内钙的变化
现代预防医学
Modern Preventive Medicine
作用。然而目前关于血钙浓度稳态的改变对细胞内钙浓度影响的研究较少，其中对肝细胞的研究尚未见 报道，因此我们选取 HepG2 人肝癌细胞系为研究对象，对不同浓度细胞外钙长时间作用后的细胞内钙浓 度进行研究，并初步探讨细胞外钙引起内钙变化的机制，为揭示不同血钙浓度对肝细胞功能的影响提供 科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 HepG2 细胞由哈尔滨医科大学生物化学教研室惠赠 1.1.2 仪器与试剂 CO2 恒温培养箱，DK-S24 型电热恒温水浴箱，HDL 超净工作台，eppendorf 离心机，MD 酶标仪， 流式细胞仪（BD，FACSCalibur） ，DMEM 培养基（Gibco） ，胎牛血清（NQBB） ，CaCl2· 6H2O（Ameresco） ， MTT、二甲基亚砜、硝苯地平、 ，NPS-2390、氯化镧(Sigma)，siTRPC1（Santa Cruz Biotechnology）其他 试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 HepG2 细胞置于 37℃,5%的 CO2 培养箱中, 用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液培养,隔日换液。 1.2.2 不同浓度细胞外钙对 HepG2 细胞活性影响 将细胞以 5× 104 个细胞/孔接种于 96 孔培养板，待细胞达 70-80% 融合后，给予不同浓度的钙溶液 （2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,5.5,6mmol/L）培养 48 h 后，用 MTT 方法进行检测钙对细胞活性的影响并选取相应的 钙浓度干预范围。 1.2.3 不同钙浓度对 HepG2 细胞的干预 将 HepG2 细胞接种于 6 孔板中， 待细胞融合达 70-80%时， 给予含有不同浓度外钙的培养液进行干预。 作用 24 h 后对细胞内钙进行染色。 用胰酶溶液将染色后的细胞从孔板壁上洗脱至 EP 管中， 细胞浓度调整 为 1x106/ml 溶液，应用流式细胞仪对细胞内钙浓度进行检测。 染色方法：弃去培养液，PBS 清洗细胞 2 次，用配制好的含 Fluo-3/AM 和 F-127 （1:1）的染色液