绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白GFP的研究与应用

摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。

关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用

1 引言

发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。

2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。

2 GFP的理化性质

从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。

GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。

3 GFP的荧光原理

GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠在氧存在的条件下使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65~67位的氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮，形成生色团。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中GFP 的一个引人注目的特点是其生色团的形成没有物种的特异性，可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。Cubitt等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。

4 GFP的荧光性质及应用优点

（1）易于检测，灵敏度高。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子,只需紫外光或蓝光激发即可发出绿色荧光。用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。

（2）荧光性质稳定。GFP对光漂白(一种荧光衰减现象)有较强的耐受性,能耐受长时间的光照,从而延长了可探测时间；GFP在pH7-12范围内也能正常发光，对高温（70℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。

（3）对细胞无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。

（4）构建载体方便。由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。

（5）可直接用于活细胞测定。GFP是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到外界信号刺激下目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察使研究更为方便。使用激光共聚焦显微镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进行三维显示。

（6）不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。

（7）广谱性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达，其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。

（8）易于得到突变体。如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光强度，适合在不同物种中专性表达。

5 GFP的应用

5.1.1 GFP作为报告基因

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如传统的荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(CUS)基因。GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面。

5.1.2 GFP作为融合标签

GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。在多数情况下GFP基因在N-或C-末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移即FRET来进行检测。

5.2 作为生物传感器

5.2.1 检测pH

野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的ph。人们通常称它们为Phluprin。分为两类:比率Phluprin和盈缺Phluprin。当pH降低时，比率Phluprin的最大激发波长从395nm到475nm迁移，利用两个最大波长处的荧光强度的比率可以测量pH;当pH值小于6时，盈缺Phluprin在475nm处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluprin都会在20ms内复原。

5.2.2 检测卤素离子

YFP(H148Q)变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检

测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递。

5.2.3 其他检测应用

另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂。