真核细胞诱导表达系统研究进展

合集下载

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。

但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。

RNA干扰的研究进展

【摘要】rna干扰( rnai) 是指内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股rna在细胞内特异性地诱导同源互补的mrna 降解, 从而阻断相应基因表达的现象。

rnai在生物界中广泛存在, 其发生过程主要分为3个阶段：起始阶段、效应阶段和扩增阶段。

它在抵御病毒感染、维持基因组稳定、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用。

随着人们对rnai研究的不断深入，rnai技术作为基因沉默的一个工具，已被广泛用于基因功能研究、疾病的靶点治疗等方面的研究。

【关键词】rnai；基因沉默；sirna；基因治疗【中图分类号】r394 【文献标识码】a 【文章编号】1008-6455（2012）02-0031-02rna干扰(rna interference, rnai)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股rna(small interfering double strand rna, sirna)诱导产生的一种转录后基因沉默(post2transcrip tional gene silencing, ptgs) 现象。

它是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，由于使用rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。

1 rnai的发现1990年，jorgensen等[1]将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。

表明不仅导入的基因未表达，而且本身同源的基因失活。

从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。

后来发现在其它许多植物中也有类似的现象。

首次发现dsrna 能够导致基因沉默的线索来源于线虫的研究。

蛋白质表达与纯化技术进展

蛋白质表达与纯化技术进展蛋白质表达和纯化技术是现代生命科学领域的重要研究方向之一。

蛋白质是生物体的重要组成部分，它们在细胞内发挥多种重要的功能，如催化代谢反应、维持细胞结构和信号传递等。

因此，研究蛋白质的结构和功能对于深入理解生命现象和开发新药物具有重要意义。

在过去的几十年中，蛋白质表达和纯化技术得到了迅猛发展。

这些技术的主要目的是在大量表达和纯化蛋白质的同时保持其结构和功能的完整性。

下面将介绍一些主要的蛋白质表达和纯化技术进展。

一、蛋白质表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是最早被开发出来的蛋白质表达系统之一。

该系统利用了细菌的表达机制来表达目的蛋白质。

原核表达系统主要包括大肠杆菌表达系统和蓝藻表达系统。

这两个系统具有表达效率高、操作简便等优点。

同时，这些系统也存在着一些问题，如无法表达复杂的蛋白质、蛋白质折叠和结构的失真等。

2. 酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统是一种简单易用的真核表达系统，被广泛应用于蛋白质的高效表达。

与其他真核表达系统相比，酿酒酵母表达系统具有表达效率高、生长速度快等优点。

由于酿酒酵母表达系统是一种酵母菌，因此其表达的蛋白质具有真核生物的折叠和修饰机制，表达的蛋白质可以更好的保持其原始性和功能性。

3. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是一种常见的真核表达系统，它利用了昆虫细胞的表达机制来表达目的蛋白质。

与其他真核表达系统相比，昆虫细胞表达系统具有表达效率高、蛋白质修饰机制完整等优点。

由于昆虫细胞表达的蛋白质具有真核生物的修饰机制，因此该系统被广泛应用于研究真核生物的蛋白质结构和功能。

二、蛋白质纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种利用配体与目标蛋白质的特异性互作来实现蛋白质分离纯化的方法。

配体可以是一种低分子物质或蛋白质，它们可以选择性地结合到目标蛋白质的表面刻痕上。

亲和层析法可以根据不同的配体选择不同的分离方法，如亲和膜、亲和树脂、亲和磁珠等。

亲和层析法具有高分离效率、简单、快速等优点，被广泛应用于蛋白质的分离和纯化。

CHO细胞表达系统研究进展

生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４　展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. [２５]㊀ＶｅｎｔｉｎｉＤＣꎬＤａｍｉａｎｉＲꎬＳｏｕｓａＡＰꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈＣＨＯ￣ｈＴＳＨｃｅｌｌｓｏｎｈｉｇｈｅｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｓｈｉｇｈｅｒｏｖｅｒａｌｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｒｈＴＳＨ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１６４(４):４０１－４０９.[２６]㊀李智ꎬ肖成祖ꎬ杨琴ꎬ等.ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养:超声－沉降柱二合一灌流系统[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００８ꎬ(４):５３－５８.[２７]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＬｅｅＹＫꎬＣｈｕｎｇＮ.Ｐｏｌｙ￣ｇａｍｍａ￣ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１２ꎬ３４(１０):１８０７－１８１０.３４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.。

真核生物转录调控的研究进展

真核生物转录调控的研究进展一、概述真核生物转录调控是分子生物学领域的前沿课题，对于理解生物体基因表达调控机制、揭示生命活动规律具有重要意义。

转录调控作为基因表达过程中的关键环节，其复杂性和动态性使得研究者们不断深入挖掘其内在机制。

在真核生物中，转录过程受到多层次、多因素的精细调控。

这包括顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用，以及转录复合物在启动子区域的组装和调控。

顺式作用元件是DNA序列中的特定区域，能够识别并结合反式作用因子，从而调控转录的起始和效率。

反式作用因子则是一类能够调控基因转录的蛋白质，包括转录因子、辅助因子等。

随着高通量测序、染色质免疫沉淀、生物信息学等技术的发展，人们对真核生物转录调控的认识不断深化。

越来越多的转录因子、顺式作用元件以及它们之间的相互作用被揭示，为我们理解转录调控的复杂性和动态性提供了有力支持。

研究者们还发现了一些新的转录调控机制，如长非编码RNA、转录后修饰等，这些新发现为转录调控研究提供了新的视角和思路。

真核生物转录调控的研究仍面临诸多挑战。

转录调控网络的复杂性使得我们难以全面理解其工作原理；不同组织、不同发育阶段以及不同环境条件下的转录调控机制可能存在差异，这使得研究更加复杂和困难。

未来真核生物转录调控的研究需要更加深入地探索其内在机制，并结合实际应用，为疾病治疗、生物育种等领域提供新的思路和方法。

1. 真核生物转录调控的重要性真核生物转录调控是生命活动中至关重要的一个环节，它决定了基因表达的时间、地点和程度，进而影响了生物体的生长、发育和代谢等各个方面。

在真核生物中，基因表达的调控主要发生在转录水平，通过转录因子、辅助因子和RNA聚合酶等复杂的相互作用来实现。

深入研究真核生物转录调控机制，不仅有助于我们理解生命活动的本质，也为疾病的治疗和生物技术的应用提供了重要的理论基础。

真核生物转录调控在发育过程中起着关键作用。

在生物体的发育过程中，不同组织和器官的形成需要特定基因的精确表达。

真核细胞表达系统

真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。

简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。

1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。

甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。

甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。

大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。

甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。

2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。

杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。

杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。

目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。

与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。

3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。

虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

基因表达系统研究进展

括：大肠杆菌、草芽孢杆菌、霉菌、枯链酵母、乳动物细胞、哺
昆虫杆状病毒、物乳腺生物反应器及植物表达系统等。动这些外源基因表达系统在基因表达量、达产物的分离纯化表及活性、成本等方面各有优缺点。
与蛋白之间的相互作用。进入后基因时代之后，大肠杆菌首
诱导表达、纯化获得所需的目的蛋白。由于细菌培养操作简单、生长繁殖快、格低廉，源价外
基因表达产物的水平高（大肠杆菌中目的蛋白的表达量如
克隆基因的表达对研究其所编码蛋白质的结构与功能
及其实际应用都是十分重要的。隆基因可以放在不同的克宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、草芽孢杆菌、枯酵母、昆虫
细胞、培养的哺乳类动物细胞。以至整体动、物。植能否使目
了表达。不容忽视的是大肠杆菌也并不是万能的宿主．但有些蛋白质必须经过翻译后修饰（糖基化、定位点的切如特割）能具有完全的生物活性，才表达这些蛋白质时最好选择
真核细胞作为宿主。大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比。有一些缺具
先被选作研究蛋白组学、因功能、白质网络等新课题的基蛋模型，示了很多基因表达的未知领域，揭同时提供了更多发

大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展

大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展祁浩;刘新利【摘要】由于DNA重组技术和蛋白组技术的发展与成熟，外源基因表达技术备受关注。

其在生物、食品、工业以及医学领域发挥着举足轻重的作用。

以原核生物细胞及真核生物细胞作为表达系统，进行目的基因序列的表达以生产蛋白疫苗、核酸疫苗和生物酶制剂等是近年来发酵工业的新型领域。

原核和真核表达系统是近年来研究和应用最广泛和最成熟的外源基因表达系统。

对近年来关于大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展进行了综述。

%Due to the rapid development of recombinant DNA technology and proteomic technology , exogenous gene expression technology has received much attention.It plays increasingly important role in the field of biological, foodstuff, industry and medical science.In recent years , the use of prokaryotic and eukaryotic expression systems for exogenous gene amplification and expression to produce proteins vaccines , nucleic acid vaccine and enzyme preparations, etc.is the emerging fields of fermentation industry.Prokaryotic expression and eukaryotic ex-pression systems were commonly used to express exogenous gene.The research progress of yeast and E.coli expression systems in recent years were reviewed.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4页(P4-6,52)【关键词】大肠杆菌表达系统;酵母表达系统;表达载体;外源基因;宿主菌株【作者】祁浩;刘新利【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q93自20世纪七八十年代以来，由于分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，各种外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟[1]。

生物学中的真核细胞分子生物学研究

生物学中的真核细胞分子生物学研究生物学中的真核细胞分子生物学是一种研究真核细胞结构、功能和动态的重要方法。

真核细胞是生物学中最复杂的细胞型，其包含许多分子机器，参与细胞的各种生理过程。

分子生物学的研究，是了解真核细胞的结构和生理机能的基础。

本文将从分子趋向的角度出发，介绍真核细胞分子生物学研究的历史、方法以及相关研究进展。

一、真核细胞分子生物学研究的历史分子生物学的发展为真核细胞分子生物学的研究打下了基础。

1953年，Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构，并提出了复制和转录的模型。

这个世纪以来，一系列基于分子生物学的技术被开发出来，包括 DNA 测序、PCR、Southern blotting、Northern blotting、Western blotting 等。

这些技术为真核细胞分子生物学的研究提供了有效的手段。

二、真核细胞分子生物学的方法真核细胞分子生物学的方法主要包括基因克隆、基因组测序、蛋白质组学、表达谱测定、 RNA 干扰和基因编辑等。

这些方法已经被广泛应用于真核细胞分子生物学研究领域。

基因克隆是分子生物学中最重要的技术之一。

它可以通过在体外重组 DNA 分子，将外源 DNA 插入到真核细胞的染色体上，从而构建特定的基因体系。

这种方法广泛应用于病毒、人类基因工程和植物工程等领域。

基因组测序是通过测定真核细胞某段基因组序列上的核苷酸排列来确定基因组的组成和结构。

近年来，高通量测序技术（如Illumina 和 PacBio）的发展，显著提高了对基因组、转录组、表达谱和蛋白质组的分析能力。

蛋白质组学是研究真核细胞蛋白质的组成、结构、功能和相互作用的科学。

研究方法包括质谱法、三维结构分析和结构生物信息学等技术。

蛋白质体组学可以帮助科学家更好的理解生物学的基本过程，并提供许多新的治疗和预防疾病的方法。

表达谱测定是对一个特定时期、特定环境下，真核细胞中基因表达情况的量化和分析。

表达谱分析可以帮助科学家理解真核细胞生命周期、分化、发展和对外部环境的反应，是真核细胞功能研究的重要方法。

兔病毒性出血症病毒VP60基因真核表达载体的构建以及在真核细胞中表达

Ｔｅｃｎｔｕｔｏｆｔｅａｂｔｅｏｒａｉｉｅｓｉｕ６ｅｅｈｏｓｃｉｎｏｂｉｈｍｒｈｇｃｄｓａｅｖｒｓｒｈｒＶＰ０ｇｎｉｅｅｋｒｏｉｘｒｓｉｎｖｃｏｄｉｘｒｓｉｎｉｕａｙｔｎｔｕａｙｔｅｐｅｓｏｅｔｒｎｓｐｅｓｏｅｋｒｏｉｈｃａｔｅｎｃ
图１ＶＰ６０基因ＲＴ— ＰＣＲ和ｐＤＮＡ— ｃＶＰ６０鉴定结身
１Ｖ６．Ｐ０基因Ｒ — ＣＴＰＲ结果；．Ｎａｋｒ００３Ｄ２ＤＡＭｒｅ２０；．
Ｍｒｅｌ００４ｐＤＡＶ６ａｋｒ５０；．ｃＮ－Ｐ０茵落ＦＲ结果：．ｃＮ —ＰＣ５ｐＤＡＶ质粒；．ｃＮ— Ｐ０粒双酶切结果；．Ｎａｋｒ２０６ｐＤＡＶ６质７ＤＡＭｒｅ５Ｃ
２２３Ｖ６基因的克隆．．Ｐ０
ＰＲ产物用０８琼脂Ｃ．％
糖凝胶电泳，照ＤＡＭｒｅ２０参Ｎａｋｒ００切取并回收目的条带，照《子克隆》（按分第三版）目的片段连将入ｐＤ８Ｔ载体，化Ｊ１９宿主菌，Ｍ１一转Ｍ０菌落ＰＲ及Ｃ质粒双酶切筛选ｐＤＶ６Ｍ－Ｐ０阳性重组质粒。
３３间接免疫荧光检测结果．
将ｐＤ－Ｐ０用Ｈｎｌ与Ｅｏ切后回ＭＶ６，ｉｄＩＩｃＲＩ酶收，同样经过双酶切处理的ｐＤＡ．（）核与ＣＮ３１＋真表达载体进行连接后转化，对重组质粒进行酶切

分子生物学：真核生物表达系统

人延长因子1基因人巨细胞病毒立早基因劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因猿猴病毒40早期基因腺病毒主要晚期启动子小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
2013年7月27日星期六
17
（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
2013年7月27日星期六
22
(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞内进行自主复制。不同的病毒复制子的工作效率不同，常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。
2013年7月27日星期六
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸化和羧化等翻译后修饰以及对原核细胞有毒性。
2013年7月27日星期六 3
一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较大肠杆菌产率蛋白酶消化
2013年7月27日星期六 26
2013年7月27日星期六
27
pCMV-HA：为Clontech公司产品，该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内含子，在N端有血凝素(HA)表位标签和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
2013年7月27日星期六 6
病毒感染转染
化学法
物理法

micro RNA

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。

RNA 干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。

随着对小分子RNA研究的不断深入，人们发现有一部分RNA分子通过激活或抑制基因转录控制基因的表达, 在基因组信息转化为分子效应和生物效应过程中发挥着重要的作用。

这种新发现的分子即是我们即将介绍的microRNA(miRNA)。

microRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA。

本文依据目前microRNA的研究进展，分别概括了microRNA的发现、合成、特征、功能和应用等方面的内容，应用方面重点介绍了在糖尿病足等慢性创面及瘢痕上取得的一些成果。

最后得出的结论是，microRNA调控着各种生物学过程，在上述疾病的发生上有重要的研究意义，虽然目前研究不甚深入，很多问题有待探索，但可以想象，microRNA的研究将会有深远的影响。

关键词：非编码RNA；microRNA；研究进展；糖尿病足；慢性创面；瘢痕引言分子生物学的中心法则是基因组DNA通过转录产生信使RNA（mRNA），信使RNA翻译成蛋白质。

然而这个法则却因为microRNA及RNAi的发现而受到了挑战，因为一部分DNA转录生成的mRNA前体（pre-mRNA）并非翻译成为蛋白质；相反，这些RNA调节其他基因的表达。

microRNA(miRNA)是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA ,长度约为22（18～25）个核苷酸（nt）的短序列,在进化上具有高度的保守性。

它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对从而抑制其翻译。

与siRNA不同的是microRNA一般不诱导mRNA的降解，而是以一种未知的方式诱发蛋白质翻译抑制，从而对基因进行转录后的表达调控。

真核表达系统

真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。

可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。

因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。

例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。

一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。

二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。

尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。

故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。

2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。

3.不持续性：内含子、外显子。

内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。

MicroRNA-144真核表达载体的构建以及对红系分化调控的研究的开题报告

MicroRNA-144真核表达载体的构建以及对红系分
化调控的研究的开题报告
1. 研究背景
红系血细胞是人体血液系统的重要组成部分，包括红血球、中性粒
细胞、单核细胞和淋巴细胞等，具有运输氧气、免疫防御等重要功能，
对于维持人体生命活动具有重要作用。

在人体血液系统的发育和疾病发
生过程中，红系血细胞的分化和调节是一个复杂的过程，其中包括转录
因子、miRNA等重要因素的参与。

因此，探究红系细胞分化相关的miRNA以及其调节机制具有重要意义。

2. 研究目的
本研究的目的是构建一个真核表达载体，将miRNA-144表达于人类细胞中，并研究其对于红系分化调控的作用。

3. 研究方法
1）设计并合成miRNA-144基因片段，并克隆进真核表达载体中；
2）构建miRNA-144的表达载体后，将其导入人类红系细胞中，通
过实时定量PCR和Western blotting等方法检测miRNA-144对于红系分
化关键基因的表达水平及其蛋白质表达行为的调控作用；
3）观察miRNA-144表达对于红系分化过程的影响并进行细胞计数
和流式细胞术等实验，证实miRNA-144对红系血细胞的分化有调节作用。

4. 预期结果
1）成功构建miRNA-144的真核表达载体；
2）miRNA-144能够对红系分化关键基因的表达水平及其蛋白质表达行为产生显著调控作用；
3）miRNA-144对于红系血细胞的分化具有显著的调节作用。

5. 研究意义
本研究将为探究miRNA在红系血细胞分化和调控中的作用提供一定参考价值，为深入研究红系血细胞分化调控机制奠定基础，并有望为红系血细胞相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。

真核载体构建

42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素）（使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction）由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双酶切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 23 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制

PHB2(Prohibitin 2)在线粒体中的研究进展

PHB2(Prohibitin 2)在线粒体中的研究进展董艳博;冯红【摘要】PHB2是真核细胞的一种在进化过程中高度保守的蛋白质,参与细胞的多种生命活动.有研究表明PHB2参与细胞周期的调节、转录调节、细胞增殖和凋亡、线粒体嵴形态的发生、信号转导等多种细胞过程.它广泛表达,分布于酵母、植物、蠕虫、苍蝇、哺乳动物等物种中,并且PHB2蛋白质是以复合物的形式定位于线粒体上.PHB2主要作为线粒体内膜的自噬受体,参与靶向线粒体的自噬和降解.研究综合了国内外的文献,对PHB2的功能,结构及表达进行阐述,为进一步研究PHB2蛋白质的功能提供了基础.【期刊名称】《天津科技》【年(卷),期】2018(045)001【总页数】4页(P36-39)【关键词】PHB2;线粒体;功能结构【作者】董艳博;冯红【作者单位】天津体育学院健康与运动科学系天津300381;天津体育学院健康与运动科学系天津300381【正文语种】中文【中图分类】Q4130 引言PHB首先作为细胞增殖的抑制剂而被发现，它的结构相当保守且普遍存在[1]。

其广泛分布于哺乳动物、原虫、植物、细菌以及真菌等生物体中。

人类基因组编码两种 PHB蛋白质，即 prohibitin 1(PHB1)和prohibitin 2(PHB2)，phb1基因位于染色体17q21上，phb2基因位于染色体 12p13上[2]。

有研究表明，PHB1和PHB2的复合物是维持线粒体的功能所必需的，该复合物组成了一个环状大分子结构，在不同的细胞过程(如细胞周期进程和衰老)以及许多疾病(如肥胖，糖尿病和癌症等)中都发挥着重要作用(见图1)[3]。

1 PHB2的结构PHB2最初是由 Terashima及其同事们发现的，因与大鼠 B淋巴细胞的 IgM 受体(Immunoglobulin M receptor，免疫球蛋白质受体)相互作用而被命名为BAP37[4]。

PHB2蛋白质的氨基端有一段疏水区域，该区域将PHB2固定在膜上；羧基端含有一个保守的PHB结构域和一个可预测的螺旋区域，在酵母细胞中该区域与 PHB蛋白质复合物的合成密切相关[5]。