结构与性能 Chapter 2

加入米隆试剂（汞和亚汞的硝酸及亚硝酸盐混合物）， 先析出沉淀，再加热时，沉淀变为砖红色。（酪氨酸 酚基）
三、蛋白质分离提纯的一般原则
• 关于蛋白质我们已知什么？
如果一个蛋白质过去已从不同的来源纯化得到，它的很多信息可应用 到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻 译后的修饰等，应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体，则根据 该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。
以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不至于丢失其生物
活性。 • 不同的组织或细胞可用不同的方法破碎； • 组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用低浓度的缓冲液）把 所要的蛋白质提取出来。 有时在肌肉组织中抽提时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）； 在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增加 溶解度。 由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有时需低温操作和加一 些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降解。
粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的 蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。 一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
细分级：样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层
析、吸附层析以及亲和层析等。
实质：破坏蛋白质分子的水化膜和中和其所带的电荷
盐析浓度：盐析所需盐的最小浓度
常用盐析电解质：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好 通常不会引起蛋白质的变性
特点：盐析法沉淀的蛋白质没有变性，去盐后活性恢复。
盐溶
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐
程度。
(4) 生物碱试剂沉淀
苦味酸、钨酸、鞣酸
3、凝固
• 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。 • 凝固的蛋白质一定发生变性。
（四）蛋白质的颜色反应 1、黄色反应 加浓硝酸，沉淀，再加热，变姜黄色。（苯环） 2、缩二脲反应 与硫酸铜的强碱溶液呈红紫色。（肽键）
3、茚三酮反应
与茚三酮溶液共热，呈蓝紫色。（α-氨基酸） 4、米隆反应
脱水作用
酸
碱 在等电点的蛋白质
脱水作用
碱
酸
－ － － － －
－ －
－
带负电荷的蛋白质
脱水作用
－ － － － －
+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
－
－
－
带负电荷的蛋白质
（三）蛋白质的变性与沉淀
1、变性
在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包 括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变。 实质：破坏次级键，改变其构象 物理因素：加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波 化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等
（分离和提纯）
不同的氨基酸等电点不同，在一定酸度的溶液中，它们荷电 程度不同，分子大小不同，在电场中的移动速度也就不同。 借此可以进行氨基酸的电泳分离。
纸电泳 (Paper electrophoresis)
练习：
现在有四个氨基酸：苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸pI=6.3、 天冬氨酸pI=2.8和赖氨酸pI=9.7，请问在以下pH条件 下进行电泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外 电场作用下，移向阳极还是阴极？
（二）胶体性质
蛋白质颗粒的直径1~100nm，属于胶体溶液。因此，
蛋白质具有亲水溶胶的性质。 布朗运动、弱丁达尔效应、不能透过半透膜、吸附
透析法(dialysis)提纯
蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶 胶的两个重要因素。
蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质
交酰胺 （主要产物）
O H2N C C OH R + H HN R
O C C OH O H2N C C HN R R O C C OH + H2O
二肽（少量）
交酰胺经盐酸或碱处理，可转变成二肽
（2）β-氨基酸受热
R CH CH COOH NH2 H R CH CH COOH + NH3
（3）γ或δ-氨基酸受热
晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。
蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件
是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制温度、加盐盐析、加有
机溶剂或调节pH等方法来达到。
重结晶：将含有杂质的固体有机物在加热下溶解在适宜的溶剂中，使成饱和溶 液。趁热过滤，去除其中的不溶物后，冷却使欲纯制的有机物重新结晶出来。
H2NCH2CH2CH2CH2NH2
（三）与亚硝酸反应
RCH-COOH + HNO2 NH2 RCH-COOH + N2 OH + H2O
范斯莱克(Van Slyke)氨基氮测定法：
根据所得氮气体积，算出氨基酸含量。
（四）受热反应 （1）α-氨基酸受热
O O C R NH2 OH + C HO O O H2N R R HN NH R
离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中
向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出
盐析（（NH4）2SO4） 盐析
盐析
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
分段盐析：
半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白，而
饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。因此，
使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的 蛋白质进行初步分离。
第二章
蛋白质的理化性质及其 分离和提纯
一、氨基酸的性质
(一)两性与等电点
RCH-COOH NH2
水溶液中存在如下平衡：
RCH-COO- 具有酸碱性 + NH3
两性离子
RCH-COO NH2
阴离子
-
H+ OH-
RCH-COO+ NH3 偶极离子
H+ OH-
RCH-COOH + NH3 阳离子
等电点(pI)：
O CH2 CH2 C OH H CH NH R CH2 CH2 O C NH + H2O CH
生成较稳定的五元环或六元环的内酰胺。
（4）氨基与羧基相隔5个或5个以上碳原子
O nNH2(CH2)mCOOH NH2(CH2)mC NH(CH2)mCO
m-2
NH(CH2)mCOOH
（五）与茚三酮反应
大多数α-氨基酸与茚三酮反应呈蓝紫色，这是鉴别α氨基酸最灵敏、最简便的方法。
纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来 说．蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失，因此应当尽量减少纯 化步骤，以期获得最大的产率。
•••••••••
蛋白质分离提纯的一般程序
一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步：
前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中
(2) 有机溶剂沉淀
凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙
酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电常数降低，蛋白
质溶解度降低。
(3) 重金属盐沉淀： 铅、铜、汞等重金属的盐类能使蛋白质凝结变性，所以能 使人中毒。万一不慎误服了重金属离子，可立即喝大量的
牛奶、鸡蛋清等来缓解毒性，以减少人体内蛋白质中毒的
测定蛋白质的含量。
• 紫外吸收性受溶液pH的影响。
二、蛋白质的性质
（一）两性电离与等电点 含有羧基及氨基，因此可以两性电离，存在等电点(pI) 等电点时，蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性都最 小，在电场中不移动。 同样，当溶液pH＝pI时，蛋白质所带正、负电荷相等；当 溶液pH＞pI时，蛋白质带净负电荷；当溶液pH＜pI时， 蛋白质带净正电荷。
对有三个可解离基团的氨基酸：
如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算： a、先写出其解离公式； b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。
如：天冬氨酸
如赖氨酸：
(二) 氨基酸的脱羧反应
RCH COOH NH2
Ba(OH)2
RCH H + CO2 NH2
脱羧酶
H2NCH2CH2CH2CH COOH NH2
蛋白质的分离
根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法 • 根据分子大小不同的分离方法
透析：其原理是溶质在浓度差的驱动下从浓度高的一侧通过分离膜渗 透到浓度低的另一侧。利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋 白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
• 蛋白质需要有多纯？
蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供研究用 的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于工业的，部分纯化就足 够了。 • 纯化蛋白的量要多少? 对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋白质；而对于进行结构 研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯度蛋白质。
• 蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重 复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体 积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。 • 纯化时间应该多长?
必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯 步骤。
结晶：蛋白质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中 数量上占优势时才能形成结晶。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量的 夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结
核糖核酸酶的变性与复性