扬州市结核分枝杆菌利福平耐药基因突变分析

扬州市结核分枝杆菌利福平耐药基因突变分析

发表时间：2019-05-28T10:05:48.223Z 来源：《医药前沿》2019年9期作者：戴洁1 曾方林1 王金富（通讯作者）1,2 [导读] 目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。

（1扬州市第三人民医院江苏扬州 225025）（2扬州大学人兽共患病学重点实验室江苏扬州 225002）【摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌利福平耐药基因的突变特征。方法：利用基因芯片检测346例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株利福平耐药基因，分析本地区利福平耐药基因突变特征。结果：346例结核分枝杆菌中利福平耐药基因发生突变的例数为58例（16.7%）。利福平rpoB基因耐药位点分布如下：531位点为58.6%，526位点为31.1%，511位点为6.9%，516位点为3.4%。结论：本地区MTB对利福

平耐药rpoB基因耐药位点以531位点最多，526位点次之。

【关键词】结核分枝杆菌；基因突变；利福平【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）09-0223-02 利福平（RFP)是从利福霉素B得到的一种半合成抗生素，能抑制细菌DNA转录合成RNA，达到杀菌作用。绝大多数的RFP耐药相关基因是rpoB（RNA聚合酶 β亚基），rpoB基因的突变会引起RFP与细菌RNA聚合酶的亲和力降低，导致细菌对RFP耐药[1]。rpoB基因的突变主要是密码子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亚单位的81-by）热点区域。514位和533位密码子突变是引起低水平耐药的常见突变位点。D516V，H526Y, H526D,S531L，这4个位点的突变是引起高水平耐药的常见突变[2]。某些密码子突变引起的rpoB基因突变并不会导致细菌对RFP耐药。本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌RFP耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2017年经传统固体培养，并经鉴定为结核分枝杆菌的菌株共346例。

1.2 仪器与试剂

仪器：基因芯片仪器、试剂由北京博奥生物有限公司提供；固体培养和药敏试剂由珠海贝索生物有限公司提供。基因芯片检测RFP rpoB基因6个位点，共13种突变型：511位CTG→CCG，513位CAA→CCA、CAA→AAA，516位GAC→GTC、GAC→TAC、GAC→GGC，526位CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CTC、CAC→CGC，531位TCG→TTG、TCG→TGG，533位CTG→CCG。

1.3 方法

1.3.1痰液化处理将痰标本用4%的氢氧化钠（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接种固体培养基和核酸提取。

1.3.2传统培养及鉴定培养严格按《结核病实验室检测操作规程》的要求进行，采用PNB和TCH进行鉴定，并定期用H37RV进行质控。

1.3.3核酸提取煮沸法提取核酸。

1.3.4基因芯片核酸进行PCR扩增，产物用杂交缓冲液处理后进行杂交，再用芯片洗干仪进行洗涤和甩干，最后用芯片判别系统进行扫描和结果判读，并详细记录芯片信息判读结果。

2.结果

346例结核分枝杆菌中耐利福平例数为58例（16.7%）。 58例利福平耐药标本中，RFP耐药相关基因rpoB基因的531（TCG→TTG）突变位点为34例（58.6%），526（CAC→TAC）突变位点为12例（20.7%），526（CAC→CGC）突变位点为5例（8.6%），526（CAC→GAC）突变位点为1例（1.7%），516（GAC→GTC）突变位点为1例（1.7%），516（GAC→TAC）突变位点为1例（1.7%），511（CTG→CCG）突变位点为4例（7.0%）。

3.讨论

MTB耐药性的增加，导致耐药结核病感染率逐年上升，加大了结核病防治的难度。许多研究表明，耐药基因突变导致是导致MTB耐药的主要原因，通过检测相关耐药基因是否发生突变，从而可推断该MTB是否发生耐药。基因芯片技术是近些年比较流行的一种基因检测的分子技术，其通过PCR技术对待测菌的基因片段进行扩增，将扩增片段与芯片杂交，即可得到基因突变位点和突变类型。该法具有快速、高通量、灵敏等特点[3]，近来在MTB耐药检测中应用广泛，我们前期的研究[4]也验证了基因芯片在MTB异烟肼耐药检测中具有较好的应用效能。

RFP主要作用于结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶的β亚单位，干扰转录的开始及RNA延伸，发挥抑菌和杀菌作用。绝大多数MTB 对RFP产生耐药是由于rpoB基因507-533位发生了突变。rpoB基因507-533位区域称为利福平耐药决定区（RRDR），约85%的耐药菌株出现531位Ser位点、526位His和516位Asp的变异。本次实验采用博奥公司生产的结核分枝杆菌耐药试剂盒检测rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533位密码子，结果显示扬州地区531、526突变位点为优势突变位点，其中531位占58.6%，526位占31.0%，最常见突变位点为531（TCG→TTG）突变位点（58.6%）和526（CAC→TAC）突变位点（20.7%），与相关文献结果相似[5,6]。

另外据相关报道最近在RFP 耐药菌株中发现了两个新的rpo B突变（Ser531Gly和 Asp516Thr），以及一个不属于rpo B基因的突变位点（Ile572Phe）[7]。然而博奥结核分枝杆菌耐药检测试剂无法包含上述所有突变基因和突变形式，在检测的结果中，有可能出RFP实际上耐药而结果敏感的情况，因此该方法检测的RFP敏感只能作为参考，并不能明确诊断，是该方法的缺点。

【参考文献】

[1] Cohen K, van Cutsem G, Boulle A, et al. Effect of rifampicin-based antitubercular therapy on nevirapine plasma concentrations in South African adults with HIV-associated tuberculosis [J].Antimicrob Chemother,2008,61(2):389-393.

[2] Madania A,Habous M,Zarzour H,et al.Characterization of mutadons causing rifampicin and isoniazid resistance of Mycobacterium tubercul-osis in Syria[J].Pol J microbiol, 2012,61(1):23-32.

[3] MOSTREM P,GORDON M,SOLA C,et al.Methods used in the molecular epidemiology of tuberculosis[J].Clinical Microbiology Infection,2002,8(11):694-704.