土壤学中的土壤微生物群落分析方法
土壤微生物宏基因组
土壤微生物宏基因组土壤微生物宏基因组是研究土壤微生物群落组成和功能的重要手段之一。
宏基因组学的兴起为我们揭示土壤微生物世界的奥秘提供了有力的工具和方法。
本文将从土壤微生物宏基因组的概念、研究方法、应用领域以及未来发展方向等方面进行介绍和探讨。
一、概念土壤微生物宏基因组是指通过高通量测序技术对土壤微生物群落中的全部基因进行测序和分析，以获取该群落的基因组信息。
与传统的微生物学研究方法相比，宏基因组学不仅可以研究单个微生物的基因组，还可以同时研究整个微生物群落的基因组，从而揭示微生物群落的结构和功能。
二、研究方法土壤微生物宏基因组的研究主要包括样品采集、DNA提取、高通量测序、数据分析和功能注释等步骤。
首先，需要在不同的土壤样品中采集微生物样品，并将其保存在适当的条件下，以保证样品的完整性和稳定性。
然后，通过DNA提取技术提取土壤微生物的基因组DNA，这是进行宏基因组测序的前提。
接下来，利用高通量测序技术对提取的DNA进行测序，获得大量的DNA序列数据。
最后，通过数据分析和功能注释等方法，对测序数据进行处理和解读，以获取土壤微生物群落的结构和功能信息。
三、应用领域土壤微生物宏基因组的研究在农业、环境和生态学等领域具有广泛的应用价值。
首先，它可以帮助我们了解土壤微生物的多样性和功能特点，揭示微生物对土壤生态系统的影响和作用机制。
其次，它可以用于评估土壤质量和健康状况，为土壤管理和农业生产提供科学依据。
此外，它还可以用于研究土壤中的微生物致病性和抗性机制，为疾病预防和治理提供理论支持。
此外，宏基因组学还可以应用于环境污染的监测和修复，为环境保护和可持续发展提供技术支持。
四、未来发展方向土壤微生物宏基因组研究在过去几年取得了长足的进展，但仍面临一些挑战和机遇。
未来的研究方向主要包括：1）进一步提高测序技术的准确性和通量，以获取更多的微生物基因组数据；2）开发新的数据分析方法和工具，以提高数据的解读效率和准确性；3）深入研究土壤微生物群落的功能特征和相互作用机制，揭示其对土壤生态系统的影响和调控机制；4）加强与其他学科的交叉和合作，如土壤学、植物学和生物信息学等，以提高土壤微生物宏基因组研究的综合应用能力。
土壤微生物多样性研究方法1
1 土壤微生物多样性研究进展土壤微生物多样性又称微生物群落结构，是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化。
它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。
生物多样性还可以定义为生命的丰富度( richness of life)，通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。
由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一。
生物多样性作为指标在监测土壤变化和对胁迫的反映方面是重要的，同时对进一步了解土壤微生物群落状态也十分有用。
随着人们对环境资源保护意识的逐步加强和因人类影响而造成的多样性损失的客观存在，目前学术界对多样性问题倍加关注。
在微生物群落研究中，微生物的均衡性、丰富性和多样性是常用的指标。
2.1 土壤微生物多样性的测试方法研究进展2.1.1 常规微生物多样性研究方法(1) 传统的微生物培养法微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。
这种方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。
平板计数法被认为是监测特殊微生物群变化的非常有效的方法；由于这种方法人为限定了一些培养条件，常常造成某些微生物的富集生长，而另一些微生物缺失。
(2) PLFA 谱图分析法磷脂脂肪酸（Phospholipid FattyAcid ，PLFA)谱图分析方法、脂肪酸（FattyAcid)和脂肪酸甲醋（Fatty Acid Methyl Ester, FAME）谱图分析方法等早己应用于对感染致病微生物以及人类和动物体内微生物卫生的研究方面。
近些年来，磷脂脂肪酸分析方法也逐渐被应用于土壤微生物多样性的研究中来，并作为土壤微生物种群变化的监测指标。
颜慧等对中国科学院红壤生态实验站长期定位试验中不同施肥处理红壤水稻土的磷脂脂肪酸( PLFA)特性及酶活性进行了分析。
结果表明：不同施肥处理的土壤酶活性、养分、微生物生物量及微生物群落多样性差异较大；施肥处理增加了PLFA 的种类和微生物量；施肥土壤的真菌 PLFA 量大于不施肥土壤，细菌 PLFA 量小于不施肥土壤，说明真菌较细菌更能适应养分贫瘠的条件。
土壤微生物生物量及多样性测定方法评述
基 金 项 目 ：国家重 点基 础研 究发 展计 划 项 目 （ ０ ７ Ｂ ０２ ０５ ；国家 “ ２ ０Ｃ ４ ７０ — ） 十一 五’ 技 支撑 计划 资 助项 目 （ ０ ６ Ａ ０ Ａ １ 科 ２０Ｂ Ｃ １０ ） 作者 简介 ：胡 婵娟 （ ９ １ 生 ） １８ 年 ，女 ，博士 ，主 要进 行景 观生 态学 和 士壤 生态 学 的研究 。Ｅｍａｌｈｃ ａｊａ１８ ＠１６ｔｏｍ － ｉ ｕｈｎｕｎ９ １ ２ ：
２ 土壤 微 生物 多样性 的研 究方法 ． ２
土壤微生物多样性测试的传统方法为分离法 ， 该方法获得 的数据在一定程度上决定 于提取 的方 法和培养基类型。并且绝大部分土壤微生物无法用 现有 的分离 方法 进行 培养 。因此 ，该 方法 有很 大 的 局 限性 。在过 去 十几年 的时 间里 ，随着测 试技术 的 进步 ，土壤微 生物群 落结 构 的测 定方 法也 得到 了迅 速地 发展 ，新 的测定 方法 的 出现 如生 物标 志物法 、 磷酯脂肪酸分析法 、 核酸分析法及碳素利用法使人 们能够更好的评价土壤微生物群落结构和多样性 。 如图 １ 示。 所 ２２１ 基 于培 养 的微 生物群 落的测 定方 法 ． ． １ 微 生物平 板 培养法 ） 微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。 这种方法主要使用不 同营养成分 的固体培养基对 土壤中可培养的微生物进行分离培养 ， 然后根据微 生物 的菌落形态及其 菌落数来计测微生物的数量 及其类型。平板培养法是进行土壤微生物分离培养 的常用方法 ，一般分为稀释 、 接种、培养和计数等 几个步骤，该方法简便易行 ， 一直以来 ， 被广泛应 用。这种方法在土壤健康的研究中应用较多 ， 许多 研 究 表 明利 用 该 方 法 得 到 的 土壤 微 生 物 的多 样 性 与土壤 的病害控制、有机质的分解等方面存在一定 的关系【 ｏ 但是有关研究表明与其他非培养方式 ３。 ］
土壤微生物群落结构研究方法
科技与创新┃Science and Technology&Innovation ·36·2020年第12期文章编号：2095－6835（2020）12－0036－02土壤微生物群落结构研究方法＊黄潇1，赵智勇1，蔡颖慧2（1.山西省分析科学研究院，山西太原030006；2.山西省生物研究院有限公司，山西太原030006）摘要：对土壤微生物群落结构研究方法进行了综述，主要有生物化学研究方法和分析生物学研究方法两大类。
生化法研究土壤微生物群落结构的方法主要包括微生物平板记数法、底物利用分析法、生物标记法。
土壤微生物在基因水平上的群落结构研究可以用核酸杂交技术、DNA成分多态性图谱分析、DNA长度多态性图谱分析、土壤宏基因组学、高通量测序技术等进行研究。
目前，分子生物学、基因技术已在微生物群落结构研究中获得了很大关注，高通量测序技术和基因组学技术也得到了更广泛的应用。
综上所述，每个方法都有各自的有优缺点，在实际选取时需要结合实际情况。
关键词：土壤；微生物群落结构；研究方法；分子生物学中图分类号：S154.3文献标识码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2020.12.0141前言土壤微生物维持着土壤物质循环和生态平衡，在植物养分转换中起着重要的作用，是土壤生态系统的重要组分。
土壤微生物的群落结构对土壤生态系统有很大影响，在调节土壤生态系统、环境治理和资源可持续利用方面具有重要意义。
研究土壤微生物多样性的方法有生物化学成分分析法和现代分子水平分析法两大类。
对土壤微生物群落结构的研究涉及多学科领域，如土壤学、微生物学及生态学等。
该项研究对应对全球气候变化、各类环境污染治理及维持生态功能等方面有重要意义。
2土壤微生物群落结构的生化研究方法生物化学法以生化角度为依据，主要包括平板记数法、底物利用分析法、生物标记法3种。
2.1平板技术——培养鉴定法此法用平板对细胞进行分离培养，后依据微生物菌落的数量和菌落的形态特征来判定微生物的数量及类型。
土壤微生物群落结构
研究土壤微生物的群落结构？
A ?
框架结构:
A 对土壤微生物群落结构的研究
采集土样，土壤的处理
A土壤理化性质分析
土壤微生物群落结构分析
A土样在理化性质情况下对土壤微 生物群落结构的影响
文献
培养条件下二氯喹啉酸对土壤微 生物群落结构的影响
（2015）
岷江干旱河谷造林对土壤微生物 群落结构的影响
166.6 μg/kg
格木林 马尾松林 上面二者混交林
旱季（1月）
雨季（7月）
4℃/风干样品 质的分析 -20℃ : PLFA
：理化性
退耕地 2003 2006 2011
立地条件不同 造林时间不同
2005 2002
A土壤理化性质分析
对土壤理化性质的分析，分别从土壤 温度、土壤PH、含水量、全氮、全碳、
A土样在理化性质情况下对土壤微生物群落结构的影响
将提取出的磷脂脂肪酸进行主成分分析，分
析土壤理化性质中生物量与总的PLFA之间的
相关性。
框架结构:
A 对土壤微生物群落结构的研究
采集土样，土壤的处理
A土壤理化性质分析
土壤微生物群落结构分析
A土样在理化性质情况下对土壤微 生物群OC、SON、 MBC、MBN…？ 对于A的切入点要考虑的仔细。
（2014）
南亚热带 3 种人工林土壤微生物生 物量和微生物群落结构特征（2013） 南亚热带乡土树种人工纯林及混
交林土壤微生物群落结构
（2014）
A
1 2 除草剂 干旱河谷造林
A的切入点
淹水和不淹水的水田土 不同浓度 不同造林时间 不同造林条件 旱季和雨季
方法
PLFA PLFA PLFA
土壤微生物分析方法
土壤微生物分析方法周丽霞1. 土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸提取法）Jenkinson and Powlson（1976）比较了γ-射线、高压灭菌、干热灭菌、氯仿熏蒸灭菌的效果，发现氯仿熏蒸灭菌处理可杀死99％以上的土壤微生物，并且未改变土壤的理化性质，且容易从土壤中除去。
因此，现在多利用氯仿熏蒸法进行土壤微生物生物量的测定。
（1）原理：土壤经氯仿熏蒸处理后土壤中的微生物被杀死，造成细胞破裂，使细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取的碳增加。
用盐溶液提取出由死后的微生物体内渗透出来的有机碳，通过测定浸提液中的碳含量，可以计算土壤微生物量碳。
（2）操作步骤：①预处理：一般不需要。
如果担心土壤状况可能会影响分析结果（如土壤太干，土壤中微生物生长不好等），可以将采集到的土壤调节其含水量达到最大持水量的60％，在25℃预培养1周。
②氯仿熏蒸处理（在通风橱内进行）：在低温下保存的土壤要先从冰箱中取出，待放置到室温时再进行分析。
称取20 g过2mm筛的新鲜土样置于50 ml 小烧杯中，放入真空干燥器内，并在真空干燥器内放置一装有去乙醇氯仿的小烧杯，烧杯内可放置几片防爆沸的干净小瓷片。
同时放入一小烧杯稀氢氧化钠溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，还应放一装水的小烧杯（或在干燥器底部放一层湿滤纸）以保持湿度。
用少量凡士林密封干燥器，在真空泵与干燥器之间可以加一缓冲瓶以防止氯仿爆沸或由于抽真空使干燥器内外压力变化而造成干燥器破裂等现象发生，然后用真空泵抽气至干燥器内氯仿沸腾。
关闭真空干燥器阀门，在25℃下暗处放置24小时。
熏蒸完成后，打开干燥器阀门（此时应听到空气进入的声音，否则可能熏蒸不彻底，要重新熏蒸），取出装水的小烧杯（或湿润的滤纸）、装有碱液和氯仿的烧杯（氯仿可倒回瓶中重复使用），用真空泵反复抽真空，并打开干燥器以除去土壤中残存的氯仿（止闻不到土壤中的氯仿气味）。
另称取等量土壤样品放入另一干燥器中，但不熏蒸，作为对照土壤。
土壤微生物研究方法
第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
（一）一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法（MPN稀释法） • 土粒法
• 稀释平板法：
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候，微生 物和土壤分离，这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落，根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多，因此必须取少 量样品制成土壤悬液，然后稀释，使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性，因此，也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况；
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • （phospholipid fatty acid 法）； • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分，具有结构多 样性和较高的生物学特异性，用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
?土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如ttctv发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化?biolog测试板含有96个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点?灵敏度高分辨力强?无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征?测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成?可以连续监测微生物的变化可批量分析该法缺点?特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用biolog碳源底物的群体
土壤微生物分析方法
土壤微生物分析方法
一、引言
土壤是地球上肥沃的生活空间，也是物质循环的重要环节。
微生物在土壤中起着重要作用，它们参与着养分、水、氮的循环，帮助植物吸收养分和水，并发挥抗病虫、降解污染物等作用，是土壤生态系统中的重要组成部分。
随着科学技术的发展，目前的研究已经逐渐从单一微生物研究转变成研究其复杂而多样的群落，并且研究微生物群落的多样性和功能。
因此，准确研究土壤微生物以及其群落结构及功能，对于土壤环境的分析和调控有重要意义。
1、液体培养法
液体培养法是一种用于分析土壤微生物群落的常用方法，它的工作原理是在恒温的培养箱中，用有机物质和无机物质组成的培养基培养土壤中的微生物，并监测它们的生长。
培养基的组成成分可以根据需要变化，以考察特定微生物的生长情况及功能。
液体培养法可以清楚的显示不同类型的微生物群落的数量和组成，为分析其功能及其影响环境的作用提供重要的参考依据。
2、分子生物学技术
分子生物学技术包括核酸提取、PCR扩增、PCR测序等技术，主要用于检测土壤中的微生物群落结构，研究其适应性、多样性、抗药性等方面的知识。
土壤微生物群落分析的实验设计方法
土壤微生物群落分析的实验设计方法土壤微生物群落是指土壤中的微生物种类和数量的总体。
它们在土壤生态系统中起着重要的作用，参与了土壤养分循环、植物生长和土壤生态系统稳定性的维持。
因此，了解土壤微生物群落的组成和功能对于研究土壤生态系统具有重要意义。
本文将介绍土壤微生物群落分析的实验设计方法。
首先，确定研究目标和问题是进行土壤微生物群落分析的第一步。
研究目标可以是探究土壤微生物群落的多样性、结构和功能，或者是研究不同土壤类型、不同植被类型或不同土地利用方式对土壤微生物群落的影响。
研究问题可以是：不同土壤类型中的微生物群落有何差异？不同植被类型对土壤微生物群落的影响如何？不同土地利用方式对土壤微生物群落的影响是否存在差异？其次，确定实验设计。
实验设计是进行科学研究的基础，合理的实验设计能够提高实验的可靠性和可重复性。
在土壤微生物群落分析中，常用的实验设计包括对照组设计、平行设计和重复设计。
对照组设计是将研究对象分为实验组和对照组，对照组不添加任何处理，用于比较实验组的结果。
平行设计是将相同处理重复进行多次，以减小误差和提高实验的可靠性。
重复设计是在同一处理下进行多次重复，以评估实验结果的可重复性。
第三，确定土壤样品采集和处理方法。
土壤样品的采集和处理是土壤微生物群落分析的关键步骤。
首先，选择合适的采样点位，代表性地采集土壤样品。
可以根据研究目标和问题选择不同的采样点位，如不同土壤类型、不同植被类型或不同土地利用方式的采样点位。
其次，采集土壤样品时需要注意避免污染和样品混杂。
可以使用无菌工具和容器进行采样，避免与周围环境接触。
采集后，需要将土壤样品进行处理，如去除杂质、破碎土壤团聚体等。
处理后的土壤样品可以用于后续的实验分析。
第四，选择合适的实验方法进行土壤微生物群落分析。
土壤微生物群落分析的方法有很多种，包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
传统的培养方法可以通过培养土壤样品中的微生物来了解其组成和数量。
土壤微生物群落的结构与功能分析
土壤微生物群落的结构与功能分析土壤是人类最重要的资源之一，其上生长着各种植物，供人类食用。
而支持土壤中植物生长的是丰富多样的土壤微生物，如细菌、真菌和原生生物等。
土壤微生物群落的结构和功能对土壤健康和生态系统的稳定性有着重要的影响。
本文将介绍土壤微生物群落的结构和功能分析方法以及它们在生态学和农业生产上的应用。
一、土壤微生物群落的结构分析土壤微生物群落的结构通常是指土壤微生物的种类和数量。
通过DNA提取和PCR扩增等分子生物学方法，可以获取一定的土壤微生物丰度数据和多样性信息。
具体而言，我们可以通过以下方法来分析土壤微生物群落的结构：1. 高通量测序技术高通量测序技术通常指Illumina测序平台。
通过将土壤DNA片段插入到Illumina通用测序适配器中，然后通过PCR扩增，最后将扩增产物纯化后进行高通量测序。
这种方法可以产生大量的数据，使得研究人员可以同时获得微生物群落的多样性和种类信息。
2. 16S rRNA测序16S rRNA基因是微生物中一种具有高度保守性的核糖体RNA分子。
利用16S rRNA基因的序列来对微生物进行分类和鉴定已成为最常用的方法之一。
通过利用引物筛选该基因片段，可以通过PCR扩增生成DNA产物然后进一步进行测序。
这种方法在微生物的培养和分离比较困难的情况下，显得尤为有用。
3. 其他方法除了高通量测序和16S rRNA测序之外，还可以利用DGGE、T-RFLP和FISH等技术来分析土壤微生物群落的结构。
二、土壤微生物群落的功能分析土壤微生物群落的功能通常包括物质循环、能量转换和生境保持等方面。
因此，在分析土壤微生物群落功能时，我们通常关注微生物拥有哪些代谢功能以及这些功能对土壤生态系统的影响。
1. 生物量测定生物量测定是通过测量微生物群落的总体积或总重量来估计微生物群落的数量和代谢活性程度的方法。
这种方法可以使研究人员更准确地预测微生物对土壤生态系统的能力。
2. 基础、包氧和脱氯代谢微生物基础代谢是指其对有机物进行分解和羟化的能力。
土壤微生物群落结构和功能的研究
土壤微生物群落结构和功能的研究土壤是生命的源泉，很多生物质的产生、循环都与土壤密切相关。
而土壤中最重要的一部分就是微生物，它们既是土壤中的分解者、养分生物转化者，也是土壤生态系中的各种结构和功能的重要组成部分。
因此，研究土壤微生物群落结构和功能，对于深入了解土壤生态环境、大力发展农业生产和保护生态环境具有重要的意义。
一、土壤微生物群落结构土壤微生物群落结构指的是不同类别、数量、分布的微生物群落在土壤中的生态位置、生态共存关系及其季节性变化。
其主要包括细菌、真菌、放线菌、放线杆菌等各种微生物。
由于各聚居微生物之间具有着复杂的相互作用，形成了一个多层次、多元化的生态环境。
在土壤微生物群落中，细菌的数量约占70%~80%，真菌占15%~20%，另外还有一些放线菌和放线杆菌。
微生物群落的特点在于，它们不是单一的生态单元，而是由各种不同的微生物共同组成，复杂而多样化。
这些微生物随着土壤的物理化学性质的不同而存在于土壤不同层次中。
而不同的环境因素，如环境温度、水分、光照、氧气含量、有机物质等等，也对土壤微生物群落的组成、数量、活性起着决定性的影响。
二、土壤微生物群落功能土壤微生物群落不仅构成了土壤生态系统的重要组成部分，也发挥着重要的功能作用。
它们主要包括有机质生物降解、养分循环和土壤肥力的形成等方面，是土壤中生物多样性和生物功能多样性的重要体现。
1、有机质生物降解土壤微生物群落在生态系统中起着具有重要功能的降解作用。
它们可分解各类有机质质，使有机质降解成更小的分子，从而释放出所含的养分，并让这些养分成为植物可利用的形式。
人们的农业生产和人类的日常生活都产生大量的有机质质，土壤中的微生物将这些质转化为氮、磷、钾等养分，保障了植物的生长发育。
在作物营养生长的不同阶段，不同种类的微生物起到不同的降解作用，并在土壤中形成不同的养分肥力水平，从而保证了农作物的正常生长发育和产量产值的增加。
2、养分循环土壤微生物群落在土壤中起着将生物体产生的有机物中的碳、氮、磷等元素无限地再次重复利用的功能。
土壤微生物群落结构研究方法综述
土壤微生物群落结构研究方法综述作者：朱菲莹肖姬玲张屹李基光梁志怀来源：《湖南农业科学》2017年第10期摘要：综述了土壤微生物传统培养方法和Biolog微平板分析碳素利用法、磷脂脂肪酸法（PLFA分析法）等微生物群落生理代谢研究方法，以及变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性长度多态性（T-RFLP）、高通量测序技术及宏基因组等微生物分子生物学技术在土壤微生物多样性研究中的应用，并对未来的发展趋势进行了展望。
关键词：土壤；微生物群落；研究方法；综述中图分类号：S154 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2017）10-0112-04Summary of Methods on Soil Microbial Community StructureZHU Fei-ying，XIAO Ji-ling，ZHANG Yi，LI Ji-guang，LIANG Zhi-huai（Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute， Changsha 410125， PRC）Abstract：The author reviews the traditional soil microbial culture method and the progress of microbial molecular biology techniques to study soil microbial diversity， including the method of Biolog， phospholipid fatty acid analysis method （PLFA）， denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）， and terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）etc. Besides， within the development of high-throughput sequencing technology and metagenomic，not only their widely usages but also the future trends in the study of diversity soil microorganism has been prospected in this paper.Key words：soil； microbial community； research methods； summary土壤微生物是土壤生态系统的重要组分，在土壤物质循环、生态平衡和植物养分转换中起着举足轻重的作用。
土壤生态学的研究现状与发展趋势
土壤生态学的研究现状与发展趋势随着全球环境变化和人类活动的加剧，土地资源面临着巨大的挑战，如何保持土地功能和提高土地利用效率越来越受到广泛关注。
而土壤作为土地资源的重要组成部分，其生态功能对于生态系统的平衡和健康起着至关重要的作用。
因此，研究土壤生态学变得越来越重要。
本文将讨论当前土壤生态学的研究现状和未来发展趋势。
1. 土壤生态学的研究现状土壤生态学是一门涉及多学科的科学，包括生态学、土壤学、微生物学、植物学、地理学等多个学科的知识。
在当前的土壤生态学研究中，主要有以下几个方面的研究内容：1.1 土壤微生物群落研究土壤微生物是土壤中最重要的生物资源之一，对土壤营养循环和有机物分解具有重要的作用。
因此，研究土壤微生物群落结构和功能，有助于理解土壤生态系统的生态学过程。
目前，研究人员采用了多种现代分子生物学技术，如PCR-DGGE、FISH、PLFA等，来分析土壤微生物群落的多样性和构成。
同时，结合土壤化学性质和环境因素分析土壤微生物和土壤水文机制，是当前土壤微生物研究的热点。
1.2 土壤养分循环研究土壤养分循环对于维持土壤肥力和健康至关重要。
目前，研究人员主要通过模拟实验和野外实践探讨土壤有机质、氮、磷等养分的运移、贮存和循环过程。
同时，从微观角度研究土壤微生物与养分循环的关系，推动了土壤生态系统的可持续发展。
1.3 土壤-植物互作研究土壤和植物之间的相互作用是土壤生态学的重要研究内容之一。
土壤中的水分、养分和微生物活动对于植物的生长和发育起着重要的影响。
而植物通过其根系的分泌物和死亡根系来调节土壤生态环境，并影响了土壤微生物的群落和功能。
此外，研究人员还通过对不同植物对土壤环境的影响研究来研究植物演化和适应性等问题。
近年来，在技术手段的快速发展下，全基因组测序等新技术在土壤-植物互作研究中得到广泛应用。
1.4 土壤污染与修复随着人类活动的不断扩大和工业化进程的加速，土壤污染已成为全球性问题。
而土壤污染不仅严重损害土壤生态系统的功能，也直接威胁到人类身体健康。
土壤微生物群落
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的分析方法
的分析方法
当前常用于进行微生物群落多样性的方法主要有磷脂脂肪酸、生理学、分子生物学等方法，但脂肪酸法更敏 感，能够快速、直接、较全面、有效提供土壤微生物群落的信息，且实验条件要求较低，结果较为客观，可靠。 因此，脂肪酸生物标记法是当前较为流行的测定微生物生物量的一种新方法。
的分布特征
土壤微生物群落
在生物和非生物因素的综合调控作用下一定面积的土壤中的病毒、 细菌、放线菌和土壤藻类等构成的生物群体
01 的定义及测度
目录
02 构建的理论基础
03 时空演变的尺度效应
04 的分析方法Байду номын сангаас
05 的分布特征
06 土壤微生物生物量周 转：睡美人悖论
基本信息
土壤微生物群落是在生物和非生物因素的综合调控作用下，一定面积或体积的土壤中的病毒、细菌、放线菌 和土壤藻类等构成的生物群体。其区系组成、种群数量、生物活性等与土壤类型、植被、气候等密切相关。
时间尺度
土壤微生物群落随着时间的演变同样具有明显的尺度效应。时间尺度上的研究跨度可以从小时、天、月到季 节、年乃至更久。在小的时间尺度上，微生物群落动态的驱动因子是间歇性脉冲式的，从而引发微生物的快速响 应。比如，在经历了长期的干旱之后，降水导致的土壤含水量的增加会发生在几分钟到几个小时或者几天的时间 里，这使得某些亲缘关系密切的特定的微生物突然复苏并持续增多，这种快速响应与氮矿化和土壤二氧化碳释放 等的变化密切相关。而在稍长的时间内，土壤微生物群落对环境条件的响应具有明显的季节性差异：春季和秋季 对土壤养分的响应最为积极，而夏季与植被之间关系密切。
空间分布特征
时间变化
空间分布特征
森林土壤微生物群落的空间分布（spatial distribution）特征是指土壤微生物群落的种类、区系组成、 种群数量和微生物生物量等在土壤剖面上的垂直变化规律、沿着经纬度的变化规律、在不同森林群落的变化规律 以及在根际周围表现出来的变化规律。
土壤微生物多样性研究方法
土壤微生物多样性研究方法3钟文辉1,233 蔡祖聪1(1中国科学院南京土壤研究所,南京210008;2南京师范大学化学与环境科学学院,南京210097)【摘要】 概述了研究土壤微生物多样性的主要方法.传统上,土壤微生物群落的分析依赖于培养技术,使用各种培养基最大限度地培养各种微生物群体,但仍只能培养和分离出一小部分土壤微生物群落.使用Biolog 分析、磷脂脂肪酸分析和核酸分析等方法,可研究和表征那些现在还不能够被培养的土壤微生物,从而获取关于土壤微生物群落多样性的更多和更完整的信息.关键词 土壤 微生物多样性 Biolog 磷脂脂肪酸 核酸分析文章编号 1001-9332(2004)05-0899-06 中图分类号 S15413 文献标识码 AMethods for studying soil microbial diversity.ZHON G Wenhui 1,2,CAI Zucong 1(1Institute of Soil Science ,Chi 2nese Academy of Science ,N anjing 210008,China ;2College of Chemist ry and Environmental Science ,N anjing Norm al U niversity ,N anjing 210097,China ).2Chin.J.A ppl.Ecol .,2004,15(5):899～904.This paper gave a review on the main methods for studying soil microbial diversity.Traditionally ,the analysis of soil microbial communities relied on culturing techniques ,using a variety of culture media.However ,only a small fraction of the soil microbial community has been cultured and isolated with this a pproach.Other methods such as Biolog GN analysis ,phospholipids fatty acids analysis and nucleic acid 2based analysis can be used to study and characterize soil microbes which currently cannot be cultured ,and to get more and complete information about soil microbial community.K ey w ords S oil ,Microbial diversity ,Biolog ,FL FA ,Nucleic acid 2based analysis.3国家杰出青年基金资助项目(40125004).33通讯联系人.2002-02-20收稿,2003-07-15接受.1 引 言生物多样性包括物种多样性、遗传(基因)多样性和生态系统多样性.土壤微生物多样性包括在栖息地中微生物分类群的多样性和在微生物分类群内的遗传多样性,以及包括群落结构的变异性、相互作用的复杂性、营养水平(tropic level )和共位群(guild )数量(功能多样性)在内的生态多样性.其中遗传多样性可认为是遗传信息在微生物聚集地或群落中的量和分布,反映微生物群落中总的遗传潜力.功能多样性则是指发生在一个群落中的碳源利用模式或作用过程数[33].土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类:一类是用于分析土壤中可培养的微生物群落;另一类是用于分析土壤的整个微生物群落.第一类分析方法基于微生物分离菌(isolates )的形态判别、微生物分离菌在Biolog GN 微滴定板中的反应和微生物分离菌的脂肪酸甲酯谱(FAME profiles )等.后一类分析方法不需要培养微生物,包括群落水平的生理特性(CL PP )分析(如在Biolog GN 微滴定板中的反应分析)、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids ,PL FA )方法和核酸分析(nucleic acid 2based analysis )方法等.2 琼脂培养基培养方法这是用于估计微生物多样性的传统方法.琼脂培养基培养方法是在琼脂培养基平板上接种培养,可作以下用途:跟踪特定分类组(group )或功能组的微生物数量,并评价在该平板上的微生物群落的组成.在后一种情况下,需从琼脂平板上将菌落分离出来,并对分离菌进行鉴定.由所得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构.培养基的成份影响微生物的生长状况,故培养基的选择可强烈影响所得菌落的多样性[34,64].菌落形成单位(CFU )的数量通常随培养基营养浓度的降低而增加[40,49].然而,只有一小部分土壤微生物群落可用这种方法得到.F •gri 等[16]用荧光显微镜检术检出的细菌数比用培养基培养得到的细菌数提高100～1000倍.根据Amann 等[3]的评估,大约80%～99%的微生物种不可培养或未能得到培养,说明大部分微生物的特征不能用传统的琼脂培养基平板培养技术来描述.此外,琼脂培养基培养方法需要使用包括分子生物学手段在内的分析技术,才能完成对微生物种的鉴定,分析工作烦琐,工作量大.由于以上局限性,在出现新的评价微生物多样性的方法,特别是分子方法以后,该传统方法已逐渐失宠.3 Biolog GN 方法Biolog GN 分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法.它是基于微生物利用碳源能力的不同,利用Biolog GN 系统来研究微生物的碳源利用模式的方法.Biolog GN 微滴定板的每一个孔中含有一种不同的碳源(共95种)、其它营应用生态学报 2004年5月 第15卷 第5期 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,May 2004,15(5)∶899～904养物和四氮唑染料.接种微生物悬浮物于微滴定板孔中后,将滴定板保温一段合适的时间,通过测定伴随的四氮唑染料的还原,而定期监测底物的氧化.Biolog GN微滴定板原来用作对细菌分离菌进行分类[6].然而,这种方法现已被改进,用于表征土壤微生物群落的功能潜力,即被用于估计诸如碳源利用模式等功能多样性[21].Biolog GN分析方法当作此用途时,接种物是来自土壤微生物群落的混合物(而不是纯培养),所得结果采用一定的统计方法进行分析.采用该方法时接种量和培养时间很重要.研究表明,底物的氧化取决于所用接种物的组成和密度[20,23,77].另外,被接种的微生物的生理状态可能影响底物利用的动力学和模式[35].在测定过程中,微生物只在含有适合其利用碳源的孔中生长[21,23,77].因此,所观察到的底物利用模式可能只反映了那些在Biolog GN微滴定板孔中能够生长的微生物的功能特性,且很可能不是所有的微生物都对Biolog反应特征有贡献[23,28].所得到的碳源利用模式也不一定反映接种的微生物群落中数量上占优势的成员的功能潜力[62].该方法已用于了解土壤[23,41,77]和根际[20]中微生物群落间的差异,也有的研究者用它确定非土著微生物或转基因植物对土壤[13,75]、植物凋落物[32,52]、根际[28]和叶际[28]微生物群落的影响.Biolog GN方法具有快速而可再现的特点.然而,该方法对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性[62],故与从琼脂平板分离微生物的传统方法有同样的局限性;另一缺点是被测试的底物不能准确地代表出现于生态系统中的底物类型.因此,Biolog反应特征只能粗略地代表实际土壤微生物群体底物利用的动力学特征.4 磷脂脂肪酸方法411 PL FA在微生物中的分布磷脂脂肪酸谱(PL FA profile)常被用于研究复杂群落中微生物的多样性[54,79].磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基本组分.PL FA是磷脂的组分,具有结构多样性和高的生物学特异性,是特别有效的生物标记物,可用于了解微生物群落结构.总PL FA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的[74],且在大多数情况下PL FA的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势.至今,已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据.PL FA或酯链PL FA(EL2PL FA)的总量已被用作土壤样品中微生物生物量的指示物(indicator)[80].细菌含有在其它生物中常见的直链脂肪酸,如油酸或顺型异油酸[十八碳2112稀酸(顺),简写为18∶1ω7或18∶1ω7c]等单不饱和脂肪酸(MU FA).然而,细菌独特的脂肪酸是具分枝链、环丙基和β2羟基脂肪酸.这些脂肪酸在其它生物体中不普遍存在[38].支链脂肪酸主要发现于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性的硫酸盐还原菌、Cytophaga 和黄杆菌属[24],而环丙基脂肪酸常见于革兰氏阴性菌株以及革兰氏阳性厌氧菌株[57].MU FA特别是18∶1ω7具有厌氧2去饱和酶途径的真细菌特征,很多这种细菌是革兰氏阴性菌[79].虽然MU FA可出现在革兰氏阳性和阴性细菌中,但在革兰氏阳性细菌中它们对总PL FA的相对贡献很少(< 20%),故MU FA可用作革兰氏阴性细菌的通用生物标记[57].多不饱和脂肪酸(PU FA)被认为是真核生物的特征性脂肪酸.亚油酸(十八碳29,122二稀酸(顺,顺),简写为18∶2ω6)可作为真菌的一个通用生物标记.但Sundh等[66]推断,这种脂肪酸可能不是对每一生态系统都合适的生物标记,可能只在植物细胞不存在的生态系统中是真菌的较好标记.非酯链未取代脂肪酸(non2ester2linked unsubstantiated FA,N EL2UNSFA)是鞘脂和缩醛磷脂的组分.鞘脂已发现存在于拟杆菌属/黄杆菌属[60].近来也发现革兰氏阴性多聚氯酚降解细菌(被鉴定为Sphingomonas属)含有鞘脂[46].缩醛磷脂主要存在于梭状芽孢杆菌属等厌氧细菌中[74],只有很少数的好氧和兼性厌氧细菌含有缩醛磷脂[79].真菌菌丝中已被检测出存在长链非酯链羟基取代脂肪酸(non2ester2 linked hydroxyl substituted FA,N EL2HYFA)[75].在脂肪酸第10位碳原子处甲基分枝是放线菌所特有的[37].表征几大类微生物的重要脂肪酸见表1.表1 表征微生物的PLFA[29,32]T able1PLFA signatures of microbes微生物类型Microbial group磷脂脂肪酸标记Phospholipids fatty acid signatures细菌Bacteria in general含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸(如15∶0、i15∶0、a15∶0、16∶0、i16∶0、16∶1ω5、16∶1ω9、16∶1ω7t、17∶0、i17∶0、a17∶0、cy17∶0、18∶1ω5、18∶1ω7、18∶1ω7t、i19∶0,a19∶0和cy19∶0等)Contain saturated or monounsaturated fatty acids ester2linked to glycerol革兰氏阳性细菌Gram2positive bacteria含有多种分枝脂肪酸Contain more branched fatty acids革兰氏阴性细菌Gram2negative bacteria含有多种羟基脂肪酸Contain more hydroxylated fatty acids;MU FA厌氧细菌Anaerobes cy17∶0,cy19∶0好氧细菌Aerobes16∶1ω7、16∶1ω7t、18∶1ω7t硫酸盐还原细菌Sulfate2reducing bacteria10Me16∶0、i17∶1ω7、17∶1ω6甲烷氧化细菌Methane2oxidizing bacteria16∶1ω8c,16∶1ω8t,16∶1ω5c,18∶1ω8c,18∶1ω8t,18∶1ω6c嗜压/嗜冷细菌Barophilic/psychrophilic bacteria20∶5,22∶6黄杆菌Flavbacteri um bal usti num i17∶1ω7,Br2OH215∶0芽孢杆菌Bacill us spp1各种枝链脂肪酸Various branched chain fatty acids放线菌Acti nobacteria10Me16∶0、10Me17∶0、10Me18∶0等真菌Fungi 含有特有的磷脂脂肪酸如18∶1ω9、18∶2ω6、18∶3ω6、18∶3ω3Contain a specific PL FA such as 18∶1ω9、18∶2ω6、18∶3ω6、18∶3ω3蓝细菌Cyanobacteria含有多不饱和脂肪酸如18∶2ω6Lipids containing polyunsaturated fatty acids such as18∶2ω6微藻类Microalgae16∶3ω3原生动物Protozoa20∶3ω6、20∶4ω6i、a、cy和Me分别表示反异(anteiso)、异(iso)、环丙基(cyclopropyl)和甲基(methyl)分枝脂肪酸009应 用 生 态 学 报 15卷412 PL FA的分离和分析PL FA的提取和分析是PL FA方法的关键步骤.PL FA 的提取主要采用简单提取、扩展提取和商用微生物鉴定系统(MIDI)提取等方法[79].简单提取用于提取EL2PL FA.先用有机溶剂提取土壤中的细胞脂类,将提取液上样于硅酸键合固相抽提柱(solid2 phase2extraction silicic acid bonded phase column,SPE2SI),分别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱,可将脂类裂解,并分离出中性脂、糖脂和磷脂.用温和碱性甲醇将磷脂水解和皂化,得到酯链脂肪酸甲酯(EL2FAME),进一步用GC或GC2MS进行定性和定量测定.这种提取方法不能将非酯链PL FA(N EL2 PL FA)从脂类中解离和提取出来.扩展提取方法是在简单提取方法的基础上延伸的,可用于提取包括EL2PL FA和N EL2PL FA在内的全PL FA.用与简单提取方法相同的操作方法从土壤样品中抽提脂类,将磷脂从脂类中解离出来,用碱性甲醇水解和皂化,接着用氨丙基键合,SPE柱(aminopropyl2bonded SPE2column,SPE2NH2)分离皂化产物,得到未取代脂肪酸甲酯.酯链羟基取代脂肪酸(EL2HYFA)甲酯和不皂化脂.未取代脂肪酸甲酯用苯磺酸键合.SPE柱(benzenesulphonic2acid2bonded SPE column, SPE2SCX)分离,得到酯链饱和脂肪酸(EL2SA TFA)、酯链单不饱和脂肪酸(EL2MU FA)和酯链多不饱和脂肪酸(EL2PU2 FA)组分.不皂化脂经酸水解后,用SPE2NH2柱分离,可得到非脂链脂肪酸(包括N EL2UNSFA和N EL2HYFA).得到的EL2PL FA和N EL2PL FA进一步用GC或GC2MS进行定性和定量分析.采用这种方法可使多数类型的脂肪酸根据它们结合成脂类的本来状况(酯链,非酯链)而得到分离.检测结果用多变量统计方法加以分析.除上述方法外,有些研究者还用MIDI来提取和分析脂肪酸[9,24,30].其操作方法包括用皂化/裂解液将脂肪酸从脂类中裂解出来,在80℃下加入甲醇盐酸溶液,使脂肪酸甲基化形成FAME,提取FAME,进行GC分析等几个步骤[24].最后,用MIDI开发商提供的自动程序软件对FAME进行分析.该方法的主要问题是提取的脂肪酸包括来自有生活力的细胞脂类和可能部分来自于细胞外的脂类[79].用简单提取方法和MIDI方法提取土壤PL FA得到的脂肪酸谱相似[9,19],一般有20至48种脂肪酸(最多72种),其中直链脂肪酸和不饱和脂肪酸分别占15%～25%和30%～50%;甲基分枝脂肪酸占25%～40%.采用扩展提取方法检测到的PL FA的数量介于190至360种之间,且显示出不同地点、不同耕种方式的土壤中脂肪酸的总量和种类数以及百分比分布有显著差异[65,81].N EL2PL FA占总PL FA量的21%～25%,EL2SA TFA和羟基取代脂肪酸(包括EL2HYFA 和N EL2HYFA)也大量存在.413 PL FA方法的特点和局限性PL FA方法是一种快速、可靠而可重现的分析土壤微生物群落结构的方法,可用于表征在数量上占优势的土壤微生物群落,包括不可培养微生物.该方法最适合用作总微生物群落分析,而不是专一的微生物种类的研究[15].PL FA的组成和浓度受土壤微生物生长条件和生理状态的影响[31,74].另外,包括PL FA在内的所有的土壤生物标记都存在可萃取性(extractability)和未知的稳定性问题.土壤的生物标记稳定性主要取决于与降解过程有直接关系的温度、湿度和其他条件[31].5 核酸分析方法511 总DNA分析研究表明,土壤微生物大体的群落组成和总的遗传多样性可通过测定群落DNA的解链行为和复性率来确定[70,73].在溶液中变性单链DNA的复性率随着DNA复杂性的增加或在溶液中不同DNA分子数量的增加而下降;DNA浓度越大,复性越快.Cot1/2表示复性一半的Cot(DNA浓度和复性时间的乘积)值,与DNA的复杂程度成正比,被用作多样性指数[71]或用于估计基因组的大小.用该方法分析表明,在未扰动的有机土壤中微生物群落基因组大小相当于6000～10 000大肠杆菌基因组的大小,而在耕作土壤或受重金属污染土壤中相当于350～1500大肠杆菌基因组的大小,且这些估计值可能是保守的[50,72].但该方法的分辨率低,只能确定土壤微生物群落的大体差异.另外,通过测定碱基在群落DNA中的分布,即鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔百分率(%G+ C),也可得到有关总的群落组成的信息[12].512 基于PCR的核糖体DNA分析51211概述 大多数DNA多样性研究以核糖体RNA (rRNA)或其编码基因rDNA为对象.在微生物多样性研究中,人们最感兴趣的是小亚基RNA(SSU rRNA)或其编码基因SSU rDNA.SSU rDNA包括保守区和变异区.保守区内核苷酸序列恒定,在分类上相距远的微生物分类群之间才有差异;变异区能够显示微生物分类种的差异.SSU rDNA的这种独特的特性可被用来对微生物进行系谱分类.目前人们已经对很多种已知微生物的SSU rDNA/rRNA序列进行了测序(大多数工作是对原核生物16S rDNA/rRNA进行的),建立了SSU rDNA/rRNA序列数据库.该数据库正在不断扩大,目前已有足够大的数据库来对微生物进行系谱分类.rDNA分析中,通常用PCR扩增SSU rDNA,扩增产物用凝胶电泳分离并进行分析.目前最常用的分析方法的基本步骤如下[7,14,43,45,55,56]:抽提土壤DNA→PCR扩增SSU rDNA(16s rDNA或18s rDNA)→PCR产物的变性梯度凝胶电泳(D GGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)分离及带谱分析→回收D GGE电泳片段→DNA序列测定→将测得的SSU rDNA序列与rDNA序列数据库中已知微生物的rDNA序列相比较→获得土壤中可能含有的微生物(包括不可培养微生物)的信息.与rDNA分析有关的问题包括rDNA序列的异质性(heterogeneity)[47]和SSU rDNA的数量变化较大[18]等. 51212DNA的抽提和纯化 抽提的DNA的质量影响后续PCR扩增的效率和准确性.抽提中应尽可能避免DNA断1095期 钟文辉等:土壤微生物多样性研究方法 裂.模板的浓度对PCR扩增有影响.过低的模板浓度可能会导致扩增失败或不正确的扩增[10],故抽提效率应该高,以保证有足够的模板浓度[26].此外,被抽提的DNA必须纯化,因为土壤中可能含有抑制PCR反应的腐殖酸[68].不同的土壤类型要用不同的DNA抽提方法[4,45].抽提方法可分为两种:一是先抽提土壤中的微生物细胞,再将细胞裂解和回收DNA;二是直接抽提土壤中的DNA.第一种方法得到的是在数量上占优势的微生物的DNA,DNA纯度较高;第二种方法较方便、抽提较完全,得到的DNA更能代表总群落[71].目前大多数研究者采用第二种方法,该方法经过改进后,已经能够做到避免腐殖酸对PCR的抑制[31].对于很多土壤,用商用抽提试剂盒能够快速而有效地直接抽提和纯化DNA[5],对另一些土壤需要用烦琐的其它抽提方法.从不同土壤类型抽提DNA的得率不同,变化范围在2～35μg・g-1之间[4].51213 rDNA的PCR扩增 首先慎重选择待扩增的rDNA 区域.rDNA的PCR扩增常采用不同的引物和扩增条件分别扩增原核微生物16S rDNA或真核微生物18S rDNA的全序列或部分序列[14,17,27,36,63].PCR扩增中存在着一些问题,如PCR产物的组成不一定反映原始DNA模板的组成[25,53,67]; PCR产物也不一定能反映原始DNA模板的相对数量.定量PCR方法操作烦琐,需要进一步改进和完善,才能在实际中应用[48].51214PCR产物的凝胶电泳分离 分离效果比较好的凝胶电泳方法有D GGE或TGGE.D GGE或TGGE均可对具有同等长度并具有不同的核苷酸序列的DNA片段进行快速、可再现分离[27,44].D GGE分离是基于DNA片段在具线性变性梯度的聚丙稀酰胺凝胶中迁移率的不同,常用的变性剂有脲和甲酰胺[44].TGGE可区分单个碱基水平发生取代的DNA 分子[61].两种方法电泳效果基本相同[27].不同微生物群落的rDNA电泳后带型不同[22].凝胶电泳的低分辩率仍然是该方法存在的一个问题[69].51215rDNA的PCR产物的分析 用PCR方法从土壤和微生物分离菌中扩增的rDNA可利用扩增的核糖体DNA限制性分析(the amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA)技术进行分析.在该方法中DNA被用一种或几种限制性酶消化,所得片段用凝胶电泳分离.该方法的不足之处是一组(分类群)微生物在分析中可得到几个片段,故分辨率较低.这个问题已在末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T2RFL P)分析中得到解决.该方法是ARDRA的发展,在PCR中引入了荧光标记的引物,PCR产物也用一种或几种限制性酶消化,借助荧光标记对消化片段进行分离和鉴定[39,42].rDNA间隔区分析(ribosomal internal s pacer analysis, RISA)[1,8]则基于原核生物16S和23S rDNA基因之间的间隔区的长度多态性,用PCR方法对该间隔区进行扩增,扩增产物用凝胶电泳分离并分析带谱,也可对DNA带进行测序,从而获得更详细的信息.513 杂交分析与rDNA的保守和变异序列同源的DNA片段可制成寡核苷酸探针,用于杂交分析.探针可用在不同的杂交技术中,包括菌落和经克隆的PCR扩增子的杂交、群落DNA的斑点印迹、狭线印迹杂交和完整细胞的荧光原位杂交(fluores2 cence in situ hybridization,FISH)[2,3,51,70].在使用印迹技术的杂交中,从细菌菌落或经克隆的PCR扩增子中来的16S和23S rRNA基因的PCR产物,可印迹到尼龙膜或硝酸纤维素膜中.该印迹与经放射性同位素、地高辛配基或其它半抗原标记的核苷酸探针杂交.这种方法常用于检测和鉴定细菌,确定土壤中细菌群体的多样性和结构[51,59],比较微生物分类群变异率[59].Ritz等[58]应用整个群落DNA杂交技术,研究了在不同条件下土壤微生物群落结构的变化.在FISH中,可用表面荧光显微镜术,对具有与荧光探针杂交的核酸分子的微生物细胞进行观察和计数[11].FISH技术使直接显现(visualization)土壤栖息地的微生物成为可能[29],可用于对土壤样品中的微生物(包括不可培养微生物)进行原位检测[3].参考文献1 Acinas SG,Anton J,Rodriguez2Valera F.1999.Diversity of free2 living and attached bacteria in offshore western Mediterranean wa2 ters as depicted by analysis of genes encoding16s RNA.A ppl Env2i ron Microbiol,65:514～5222 Amann RI,K rumholz L,Stahl DA.1990.Flu orescent2olig onucleotide prob2 ing of whole cells for determ inative,phylogenetic,and environmental studies in m icrobiology.J Bacteriol,172:762～7703 Amann RI,Ludwig W,Schleifer KH.1995.Phylogenetic identifica2 tion and in situ detection of individual microbial cells without culti2 vation.Microbiol Rev,59:143～1694 Anthony G,O’Donnell,G rres EG.1999.16S rDNA methods in soil microbiology.Current Opi nion Biotechnol,10:225～2295 Barthelet 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al.1997.Changes in soil mi2 crobial properties and phospholipid fatty acid fractions after chloro2 form fumigation.Soil Biol Biochem,29:1325～1336作者简介 钟文辉,男,1965年生,博士,副教授,主要从事环境微生物学和环境生物技术研究,发表论文20多篇,出版专著和高校教材4部.E2mail:w.h.zhong@409应 用 生 态 学 报 15卷。
土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望21
土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望21土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望摘要：土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机质分解、养分释放和能量释放中起着重要作用量转移等中起着重要作用。
随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进,土壤微生物群落结构多样性,尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。
本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状,并对其未来研究方向进行了合理展望。
关键词：微生物群落结构土壤微生物群落土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等。
土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素,土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用。
由于土壤中微生物个体微小,数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因,目前为止大约仅1～10%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物在陆地生态系统中重要作用的认识。
虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。
近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群土壤微生物结构及其影响因素的研究、土壤微生物结构与生态功能的关系以及土壤微生物对土壤质量的维持，越来越受到土壤科学家、生态学家和微生物学家的重视。
[1]许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%~10%，传统的土壤微生物研究方法如分离计数法、显微镜法往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，虽然使用电子显微镜或荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态多样性进行观察，但是这两种方法并不能描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。
随着微生物研究技术的发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法。
土壤里的微生物
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养分循环与供应
氮素循环
微生物参与氮的固定、氨 化、硝化、反硝化等过程 ，实现氮素在土壤中的循 环与转化。
2024/1/30
磷素转化
微生物通过分泌有机酸等 物质，促进土壤中难溶性 磷的溶解和转化，提高磷 的有效性。
钾素释放
病虫害防治
一些土壤微生物能够产生抗生素类物质，对土传病害和虫害具有 一定的防治作用。
2024/1/30
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05
CATALOGUE
影响土壤微生物生长繁殖因素
2024/1/30
19
温度和湿度变化
2024/1/30
温度
土壤温度对微生物的活性有很大影响。一般来说，土壤微生 物在适中的温度下生长繁殖最为活跃。极端的温度条件会抑 制微生物的生长，高温会干燥土壤并杀死微生物，而低温则 会减缓微生物的代谢活动。
湿度
土壤湿度也是影响微生物生长的重要因素。微生物需要水分 来进行代谢活动，但是过多的水分会导致氧气不足，从而影 响好氧微生物的生长。适宜的土壤湿度有助于维持微生物群 落的多样性和活性。
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pH值和盐分浓度
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pH值
土壤的酸碱度对微生物的生长和繁殖具有重要影响。不同的微生物对pH值的适 应范围不同，一些微生物喜欢酸性环境，而另一些则喜欢碱性环境。极端的pH 值条件会限制某些微生物的生长，从而影响土壤微生物群落的组成和活性。
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加强农田管理措施，改善土壤环境
深耕深松
通过深耕深松等耕作措施，打破土壤板结层，增加土壤通 气性和透水性，有利于土壤微生物的生长和繁殖。
排水防涝
建立完善的农田排水系统，防止土壤积水导致微生物缺氧 死亡，保持土壤良好的通气状况。
农田土壤微生物群落的分析与鉴定
农田土壤微生物群落的分析与鉴定农田土壤微生物群落是一个庞大而复杂的生态系统，其中包含了大量的微生物种类和数量。
这些微生物对于土壤的养分循环、有机物分解和植物生长等过程起着重要的作用。
因此，对农田土壤微生物群落的分析与鉴定具有重要的科学意义和实践价值。
一、农田土壤微生物群落的多样性农田土壤微生物群落的多样性是指微生物在土壤中的种类和数量的丰富程度。
通过对不同农田土壤样品的采集和分析，可以发现土壤微生物群落的多样性具有明显的差异。
不同土壤类型、不同植被类型、不同农作物种植方式等因素都会对土壤微生物群落的多样性产生影响。
通过对农田土壤微生物群落的分析与鉴定，可以更好地了解土壤微生物的多样性及其与土壤环境的相互关系。
二、农田土壤微生物群落的功能农田土壤微生物群落的功能主要包括有机物分解、养分循环和植物生长等方面。
土壤中的微生物可以分解有机物质，将其转化为植物可利用的养分，促进植物的生长发育。
同时，土壤微生物还能够参与土壤中养分的循环过程，如氮循环、磷循环和硫循环等，使得养分得以有效地利用和再利用。
通过对农田土壤微生物群落的分析与鉴定，可以更好地了解土壤微生物的功能及其对土壤生态系统的影响。
三、农田土壤微生物群落的鉴定方法农田土壤微生物群落的鉴定方法主要包括传统培养法和分子生物学方法。
传统培养法是通过将土壤样品接种到培养基中，利用微生物的生长特性和形态特征进行鉴定。
这种方法可以鉴定出一部分可培养的微生物，但对于非可培养微生物的鉴定存在一定的局限性。
分子生物学方法则是利用PCR技术和高通量测序技术等手段，对土壤样品中的微生物进行基因分析和测序，从而鉴定出更多的微生物种类和数量。
这种方法具有高通量、高灵敏度和高准确性的特点，能够更全面地了解土壤微生物群落的组成和结构。
四、农田土壤微生物群落的应用前景农田土壤微生物群落的分析与鉴定对于农业生产和土壤生态环境的改善具有重要的应用前景。
通过对土壤微生物群落的分析与鉴定，可以了解土壤微生物的多样性和功能特点，为优化土壤管理和农作物栽培提供科学依据。
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土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系，其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用，包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此，对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况，为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术
近年来，随着高通量测序技术的不断发展和成熟，DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中，Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势，能够产生数百万到数十亿个序列，适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制，如读长
短、测序偏差和寡核苷酸错误等，需要进行数据过滤和样本对比
等后续分析。
二、FISH技术
FISH（Fluorescence In Situ Hybridzation）是一种在原位的方法，能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA
探针标记靶细胞的核酸序列，配合荧光探针进行检测和成像，可
以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优
势在于高分辨率的成像和定量准确性，能够提示具体的微生物存
在形态，如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术
PCR-DGGE（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因，然
后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳
道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
通过切割目标区域进
行提取，洗脱，重新测序得到相应的DNA序列。
该技术具有毛弱
单细胞提供了微生物群落结构和定量的信息，其优点在于无需知
道组成物质的成分，快速，简单，成本低，但是可控性差，存在
某些微生物有误解的可能性。
四、功能基因芯片
功能基因芯片技术是一种高通量感知多样性和功能基因的方法，通过内置多个微生物基因和探针，可大规模快速评估微生物群落
的组成和功能。
该技术不需要进行PCR扩增，可以通过多重探针
直接检测样品中的基因，检测结果还可以用于构建微生物群落功
能图谱，揭示微生物在有机物分解、氮循环、硫循环、酸碱调节
等方面的作用。
综上所述，土壤微生物群落的分析方法主要包括DNA测序技术、FISH技术、PCR-DGGE技术和功能基因芯片技术等。
这些方
法各有优缺点，且需要根据研究问题和实验条件等因素综合选用。
期望这些方法能为更好的了解土壤微生物群落提供一定的帮助。