补体实验报告

补体实验报告

篇一：补体结合实验

第二节补体结合实验

补体结合实验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反映系统抗原或抗体的实验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反映。这一传统的实验经不断改良，除用于传染病诊断和流行病学调查之外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原和hla的检测和分析中也有应用。

一、类型及原理

自身免疫性溶血，若是有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜解决复合物（membrane attack complex），它可以直接解决红细胞膜，致使红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。

该实验中有5种成份参与反映，分属于3个系统：①反映系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；

②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，实验时常将其预先结合在一路，形成致敏红细胞。反映系统与指示系统争夺补体系统，先加入反映系统给其以优先结合补体的

机缘。

若是反映系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反映后可结合补体；再加入指示系统时，由于反映液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合实验阳性。若是反映系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合实验阴性（图14-2）。因此补体结合实验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。

图14-2补体结合实验示用意

二、实验方式

补体结合实验的改良方式较多，较常常利用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方式应用较为普遍，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也

较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。

（一）试剂

1．抗原实验顶用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如利用粗制抗原时，须经一样处置的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成份的非特异性反映。

2．抗原和抗本的滴定补体结合实验中，抗原与抗体按

必然比例结合，因此应通过实验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体二者都呈强阳性反映（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。滴定方式举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。依如实验方式加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式实验中，抗原一般采用2～4个单位（1:64～1:32），抗体采用4个单位（1:8）。

表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 抗体对照

抗血清稀释倍数1:4 4 4 4 4 4 4 3 0 0

1:8 4 4 4 4 4 2 1 0 0

1:16 4 4 4 4 4 1 0 0 0

1:32 4 4 4 4 ④0 0 0 0

1:64 4 4 3 3 2 0 0 0 0

1:128 4 3 2 1 ±0 0 0 0

1:256 3 2 2 ±0 0 0 0 0

1:512 2 1 ±0 0 0 0 0 0

抗原对照0 0 0 0 0 0 0 0

注：一、二、3、4别离表

示溶血反映强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。

3．补体滴定按表14-5慢慢加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，肯定为1个实用单位，正式实验中利用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，

按比例公式0.12×2:60＝0.2:x计算，x＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。

表14-5补体的滴定

管号

1:60补体（ml）缓冲液（ml）稀释抗原（ml）

致敏srbc （ml）

1 2 3 4 5 6

0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14

0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

浴30min 37℃水置放

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

浴30min 37℃水置放

不溶血不溶血微溶血微溶血全溶血全溶血

结果

（二）血清标本

收集血液标本后及时分离血清，及时查验或将血清保留

于－20℃。血清在实验前应先加热56℃30min（或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处置之一：①加热提高12；②－20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/l盐酸处置；④加入少量补体后再加热灭活；⑤以白陶土处置；⑥通入co2；⑦以小白鼠肝粉处置；⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。

（三）正式实验

以小量法测定抗体的补体结合实验为例。按表14-6慢慢加入各类试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应别离为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不该出现自发性溶血。补体对照管应呈现2u为全溶，1u为全溶略带有少量红细胞，0.5u应不溶。如0.5u补体对照出现全溶表明补体用量过量；如2u对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行实验。补体结合实验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。

表14-6测定抗体的补体结合实验操作程序

反映物（ml）待检血清管

测定

稀释血清抗原缓冲液2u补体1u补体0.5u补体致敏红细胞