农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
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经过 4 种侵染时间处理的实验结果表明, 侵染 3 min 时产生的抗性植株数量较少, 每块叶盘上只有 56 个再生芽; 而 6 min 和 9 min 处理的效果未见明显 不同, 每块叶盘的再生芽约为 1620 株。12 min 侵染 使得农杆菌浓度太高, 即使在 Carb 600 mg/ L 的作用 下, 外植体上会有肉眼可见的菌体污染, 甚至最后被 繁殖的农杆菌包裹, 使外植体褐化死亡。鉴于此, 建 议侵染时间选用 69 min。 2. 4 卡那霉素选择压的确定
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
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2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
收稿日期: 2004- 06-20 基金项目: 国家高技术研究发展计划( 863 计划) 资助项目( 2001AA241132) 作者简 介: 张 宁 ( 1975- ) , 女, 甘 肃 榆 中人, 讲 师, 博 士, 主 要 从 事 作物 生 物 技 术及 遗 传 育 种研 究。 联系 电 话: ( 0931) 763 1387。
养, 每 30 d 继代繁殖一次。 1. 1. 2 农杆菌菌株和质粒 试验用根癌农杆菌( Agrobacterium tumef aciens ) 菌株为 LBA4404, 含植物表达 载体 pBI121, 其结构如图 1, 抗性标记为 Km, 由载体 上的 npt II 基因编码。
图 1 表达载体 pBI121 的 T- DNA 结构
的植株数量又比较少, 转化效率不高。当叶盘大小 为 1. 0 cm @ 1. 0 cm 时, 平均每块叶盘上分化的植株 多达 20 株, Km 抗性生根筛选时, 平均每块叶盘可产 生 11 株抗性芽, 阳性率为 5510% ( 表 1) 。
表 1 不同大小叶盘的转化频率
叶盘大小
平均分化 植株数 ( 株/ 块)
中, 目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方 法便是根癌农杆菌( Agrobacterium tumef aciens ) 介导的 遗传转化技术。在已获得的近 200 种转基因植物中 约有 80% 是由农杆菌介导完成的[ 1] 。近年来, 这种 纯生物 的方法 由于具 有转 化率 高, 可 导入 大片 段 DNA, 且导入基因的拷贝数低, 表达效果好, 仪器和 操作技术较简单等优点, 引起了人们的极大关注[ 2] 。 该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传
关键词: 烟草; 农杆菌; 叶片; 遗传转化; PCR 鉴定 中图分类号: Q78 文献标识码: A 文章编号: 1001- 1463( 2004) 09- 0011- 03
随着分子生物学和基因工程的飞速发展, 在许 多未知基因功能的鉴定、基因的各种调控元件如顺
式调控元件、反式作用因子等机理的研究中, 烟草往 往被作为转基因的模式受体植物。在植物基因工程
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农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
张 宁, 王 蒂
( 甘肃农业大学农学院, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 通过对农杆菌介导的烟草 遗传转 化方法进 行优 化, 建 立了 一种快 速高 效的 烟草叶 盘遗 传转化 体系。
用 OD600为 0. 5 的农杆菌悬浮液侵染大小约 1 cm @ 1 cm 烟草叶盘 6~ 9 min, 然后置于以 MS 为基本培 养基附加 2. 25 mg/ L 6-BA 和 0. 3 mg/ L NAA 的分化培养基上, 在 100 mg/ L 卡那 霉素选择压 下, 2128 d 可获得 抗性不 定芽。通过 卡 那霉素生根筛选和 PCR 扩增鉴定, 其阳性转基因植株频率可达 57. 1% 。
5 栽培技术要点 根据当地气候情况, 新品系 90109( 13)- 1- 2- 1 宜
在气温 14~ 16 e 、0~ 5 cm 地温稳定在 16~ 18 e 时 播种。播种密度 330 万~ 375 万粒/ hm2, 宜保穗 600 万~ 675 万穗/ hm2。应重施基肥, 增施磷肥, 一般在 基施农家肥 30 t/ hm2、过磷酸钙 750 kg/ hm2、尿素 150 kg/ hm2 的基础上, 返青期再追施尿素 112. 5 kg/ hm2。 拔节至抽穗期叶面喷施 2~ 3 g/ kg 的磷酸二氢钾溶
1. 1. 3 酶和试剂 T aq DNA 聚合酶购自上海生物 工程 ( Sangon) 公 司, PCR 引 物由 Sangon 公司合 成。 利福平( Rif) 和卡那霉素( Km) 为 Sigma 公司产品, 羧 苄青霉素( Carb) 和其它试剂为国产分析纯。 1. 2 转化方法
烟草转化采用叶盘法[ 4] 。农杆菌活化: 随机挑 取含有质粒 pBI121 的农杆菌 LBA4404 的单菌落接 种于 LB[ 5] 附加 50 mg/ L Km 和 25 mg/ L Rif 的培养 基 中, 于28 e 、240 r/ min摇床上 过夜培养 至OD600
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转化植株的形态发生了变异, 其节间缩短, 叶片较野 生型细长, 形态突变率约为 4% 。推测其原 因是当 外源基因整合到烟草基因组中时, 插入位点是随机 的, 可能恰好破坏了烟草本身控制植株形态生长发 育的关键基因, 或是造成了某些代谢基因的表达受 阻, 所以出现了低频率的突变株。其余 121 株转化 烟草移入 Km 100 mg/ L 进行生根筛选实验, 初步筛 选的生根植株有 90 株, 其余植株未生根, 可能为假 阳性植株。对生根植株进行 npt II 基因特异片段的 PCR 扩增检测, 其中有 72 株得到了预期扩增片段, 大小约为 676 bp( 图 2) , 而其余 18 株与未转基因的 阴性对照均未扩增到该片段。经 PCR 扩增筛选, 其 正常阳性转基因植株频率为 57. 1% 。
在 该实 验中获得 的126株转化 植株中, 有5株
甘肃农业科技 2004 年 第 9 期
Gansu Agr . Sci . and Techn. No . 9 2004
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表 2 卡那霉素不同选择压的阳性植株频率
化 的植株数 ( 株/ 块)
Km 筛选的阳性 植株频率 ( %)
液 1~ 2 次, 在条锈病发生年注意防条锈病, 降水多 的年份注意防倒伏。
( 本文责编: 程亚军)
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为 0. 5 左右; 然后于 5 000 r/ min 离心 6 min, 其沉淀 用 MS 液体培养基重新悬浮备用。 1. 2. 1 烟草叶盘外植体 将无菌烟草试管苗植株 的叶片剔除叶脉后剪成小方块, 其大 小分别为 1. 5 cm @ 1. 5 cm、1. 0 cm @ 1. 0 cm 和 0. 5 cm @ 0. 5 cm 三 组。 1. 2. 2 叶盘外植体预处理 经预培养 3 d 和不经 预培养两种处理, 预培养基与共培养基、分化培养基 成分相同, 其组成为 MS 附加 BA 2. 25 mg/ L、NAA 0. 3 mg/ L 和蔗糖 3% , 培养基 pH 5. 8。 1. 2. 3 侵染 将烟草叶盘置于上述活化的农杆菌 悬浮液中浸泡, 间歇摇动使叶片与菌液充分接触, 侵 染时间分别为 3、6、9、12 min。侵染完毕后取出叶盘 用无菌滤纸吸干表面菌液, 转入固体分化培养基中, 于 28 e 、黑暗条件下共培养 2 d。 1. 2. 4 分化培养选择压及生根选择压的确立 将 叶片转移到附加不同浓度 Km 和 Carb 500 mg/ L 的 同种分化培养基上, 置于 25 e 连续光照培养箱中进 行培养。Km 选 择压浓度 分别设置 为 50、100、150、 200 mg/ L。被转化的细胞 因携带有 npt II 基 因而对 培养基中的 Km 具有抗性, 所以在正常范围的 Km 选 择压下可以存活并再生植株, 而未转化细胞则不能。 待分化的抗性不定芽长出达 1 cm 时, 将其切下转入 MS 附加 Km 100 mg/ L 和 Carb 200 mg/ L 的培养基上 进行抗性植株生根筛选。 1. 2. 5 转基因植株 PCR 检测 在 Km 抗性培养基 中生根的烟草转化植株, 置 于 MS 培养基上 扩大繁 殖。从烟草叶片中提取植物总 DNA 进行 PCR 扩增 鉴定。DNA 的提 取按 Edwards 等 的小量 DNA 提 取 方法进行[ 6] 。以转化植株的 DNA 为模板, 未转化植 株作 阴 性对 照。用 npt II 基 因 的两 个 引物 5.- GCTATGACTGGGCACAACAG- 3 . 和 5 .-ATACCG-TAA AGCACGAGGAA- 3. 进行 PCR 扩增。扩 增 条 件 为: 94 e 、3 min, 94 e 、45 s, 56 e 、45 s, 72 e 、1 min, 35 个循环, 72 e 延伸 5 min, 预期扩增片段大小 为676 bp。 2 结果与分析 2. 1 叶盘大小对转化频率的影响
在上述烟草转化体系中, 叶盘的分化能力可长 达 30 d 左右, 每块叶盘上分化的再生芽总数可高达 40 株, 所以后期对假阳性植株的剔除工作量就非常 大。因此, 该实验在分化培养基中加入不同浓度的 Km, 来确定选择压的适宜浓度, 以便在早期获得较 高频率的阳性 植株。从表 2 可以看出, Km 浓度为 50 mg/ L 时, 分化率虽然较高, 但阳性植株频率约为 100 mg/ L 选择压时的一半。当 Km 浓度升高至 150 mg/ L 和 200 mg/ L 时, 会逐渐严重影响植株的分化。 综合比较, 用 Km 100 mg/ L 浓度筛选时, 有较高的植 株分化率和阳性植株频率, 从而被确定为烟草叶盘 转化 Km 最适选择压。 2. 5 转基因植株 PCR 鉴定结果
2农杆菌菌株和质粒试验用根癌农杆菌a2随着分子生物学和基因工程的飞速发展在许多未知基因功能的鉴定基因的各种调控元件如顺式调控元件反式作用因子等机理的研究中烟草往往被作为转基因的模式受体植物
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14( 3/ 10/ 30) 、水源 14 类 型感染中梁 17( 3/ 10/ 30) 、 Hy3( 4/ 40/ 100) 、条中 31 号 ( 4/ 25/ 100) 、混合 菌( 3/ 10/ 70) 均表现感染, 为中感品种, 但在大田具有成株 耐锈性。 4 适宜种植地区及栽培技术要点
冬小麦 新品系 90109( 13)- 1- 2- 1 适 宜在甘肃 东 部及陕北、宁夏彭阳等地推广种植。
烟草叶盘外植体在含有 Km 的分化选择培养基 上培养时, 叶盘首先会膨大, 可达原体积的一倍。培 养 21~ 28 d 后, 形成抗性愈伤组织和丛生芽。实验 结果表明, 叶盘若太大, 体积膨大时, 使得外植体的 各部位不能充分接触 Km 抗性培养基, 因而假阳性 转化植株出现的频率较高, 从而会加大后期的选择 工作量。而叶盘太小, 如 0. 5 cm @ 0. 5 cm 时, 分化
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
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1. 0 cm @ 1. 0 cm
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0. 5 cm @ 0. 5 cm
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2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
收稿日期: 2004- 06-20 基金项目: 国家高技术研究发展计划( 863 计划) 资助项目( 2001AA241132) 作者简 介: 张 宁 ( 1975- ) , 女, 甘 肃 榆 中人, 讲 师, 博 士, 主 要 从 事 作物 生 物 技 术及 遗 传 育 种研 究。 联系 电 话: ( 0931) 763 1387。
养, 每 30 d 继代繁殖一次。 1. 1. 2 农杆菌菌株和质粒 试验用根癌农杆菌( Agrobacterium tumef aciens ) 菌株为 LBA4404, 含植物表达 载体 pBI121, 其结构如图 1, 抗性标记为 Km, 由载体 上的 npt II 基因编码。
图 1 表达载体 pBI121 的 T- DNA 结构
的植株数量又比较少, 转化效率不高。当叶盘大小 为 1. 0 cm @ 1. 0 cm 时, 平均每块叶盘上分化的植株 多达 20 株, Km 抗性生根筛选时, 平均每块叶盘可产 生 11 株抗性芽, 阳性率为 5510% ( 表 1) 。
表 1 不同大小叶盘的转化频率
叶盘大小
平均分化 植株数 ( 株/ 块)
中, 目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方 法便是根癌农杆菌( Agrobacterium tumef aciens ) 介导的 遗传转化技术。在已获得的近 200 种转基因植物中 约有 80% 是由农杆菌介导完成的[ 1] 。近年来, 这种 纯生物 的方法 由于具 有转 化率 高, 可 导入 大片 段 DNA, 且导入基因的拷贝数低, 表达效果好, 仪器和 操作技术较简单等优点, 引起了人们的极大关注[ 2] 。 该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传
关键词: 烟草; 农杆菌; 叶片; 遗传转化; PCR 鉴定 中图分类号: Q78 文献标识码: A 文章编号: 1001- 1463( 2004) 09- 0011- 03
随着分子生物学和基因工程的飞速发展, 在许 多未知基因功能的鉴定、基因的各种调控元件如顺
式调控元件、反式作用因子等机理的研究中, 烟草往 往被作为转基因的模式受体植物。在植物基因工程
11
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
张 宁, 王 蒂
( 甘肃农业大学农学院, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 通过对农杆菌介导的烟草 遗传转 化方法进 行优 化, 建 立了 一种快 速高 效的 烟草叶 盘遗 传转化 体系。
用 OD600为 0. 5 的农杆菌悬浮液侵染大小约 1 cm @ 1 cm 烟草叶盘 6~ 9 min, 然后置于以 MS 为基本培 养基附加 2. 25 mg/ L 6-BA 和 0. 3 mg/ L NAA 的分化培养基上, 在 100 mg/ L 卡那 霉素选择压 下, 2128 d 可获得 抗性不 定芽。通过 卡 那霉素生根筛选和 PCR 扩增鉴定, 其阳性转基因植株频率可达 57. 1% 。
5 栽培技术要点 根据当地气候情况, 新品系 90109( 13)- 1- 2- 1 宜
在气温 14~ 16 e 、0~ 5 cm 地温稳定在 16~ 18 e 时 播种。播种密度 330 万~ 375 万粒/ hm2, 宜保穗 600 万~ 675 万穗/ hm2。应重施基肥, 增施磷肥, 一般在 基施农家肥 30 t/ hm2、过磷酸钙 750 kg/ hm2、尿素 150 kg/ hm2 的基础上, 返青期再追施尿素 112. 5 kg/ hm2。 拔节至抽穗期叶面喷施 2~ 3 g/ kg 的磷酸二氢钾溶
1. 1. 3 酶和试剂 T aq DNA 聚合酶购自上海生物 工程 ( Sangon) 公 司, PCR 引 物由 Sangon 公司合 成。 利福平( Rif) 和卡那霉素( Km) 为 Sigma 公司产品, 羧 苄青霉素( Carb) 和其它试剂为国产分析纯。 1. 2 转化方法
烟草转化采用叶盘法[ 4] 。农杆菌活化: 随机挑 取含有质粒 pBI121 的农杆菌 LBA4404 的单菌落接 种于 LB[ 5] 附加 50 mg/ L Km 和 25 mg/ L Rif 的培养 基 中, 于28 e 、240 r/ min摇床上 过夜培养 至OD600
50
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200
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转化植株的形态发生了变异, 其节间缩短, 叶片较野 生型细长, 形态突变率约为 4% 。推测其原 因是当 外源基因整合到烟草基因组中时, 插入位点是随机 的, 可能恰好破坏了烟草本身控制植株形态生长发 育的关键基因, 或是造成了某些代谢基因的表达受 阻, 所以出现了低频率的突变株。其余 121 株转化 烟草移入 Km 100 mg/ L 进行生根筛选实验, 初步筛 选的生根植株有 90 株, 其余植株未生根, 可能为假 阳性植株。对生根植株进行 npt II 基因特异片段的 PCR 扩增检测, 其中有 72 株得到了预期扩增片段, 大小约为 676 bp( 图 2) , 而其余 18 株与未转基因的 阴性对照均未扩增到该片段。经 PCR 扩增筛选, 其 正常阳性转基因植株频率为 57. 1% 。
在 该实 验中获得 的126株转化 植株中, 有5株
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表 2 卡那霉素不同选择压的阳性植株频率
化 的植株数 ( 株/ 块)
Km 筛选的阳性 植株频率 ( %)
液 1~ 2 次, 在条锈病发生年注意防条锈病, 降水多 的年份注意防倒伏。
( 本文责编: 程亚军)
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为 0. 5 左右; 然后于 5 000 r/ min 离心 6 min, 其沉淀 用 MS 液体培养基重新悬浮备用。 1. 2. 1 烟草叶盘外植体 将无菌烟草试管苗植株 的叶片剔除叶脉后剪成小方块, 其大 小分别为 1. 5 cm @ 1. 5 cm、1. 0 cm @ 1. 0 cm 和 0. 5 cm @ 0. 5 cm 三 组。 1. 2. 2 叶盘外植体预处理 经预培养 3 d 和不经 预培养两种处理, 预培养基与共培养基、分化培养基 成分相同, 其组成为 MS 附加 BA 2. 25 mg/ L、NAA 0. 3 mg/ L 和蔗糖 3% , 培养基 pH 5. 8。 1. 2. 3 侵染 将烟草叶盘置于上述活化的农杆菌 悬浮液中浸泡, 间歇摇动使叶片与菌液充分接触, 侵 染时间分别为 3、6、9、12 min。侵染完毕后取出叶盘 用无菌滤纸吸干表面菌液, 转入固体分化培养基中, 于 28 e 、黑暗条件下共培养 2 d。 1. 2. 4 分化培养选择压及生根选择压的确立 将 叶片转移到附加不同浓度 Km 和 Carb 500 mg/ L 的 同种分化培养基上, 置于 25 e 连续光照培养箱中进 行培养。Km 选 择压浓度 分别设置 为 50、100、150、 200 mg/ L。被转化的细胞 因携带有 npt II 基 因而对 培养基中的 Km 具有抗性, 所以在正常范围的 Km 选 择压下可以存活并再生植株, 而未转化细胞则不能。 待分化的抗性不定芽长出达 1 cm 时, 将其切下转入 MS 附加 Km 100 mg/ L 和 Carb 200 mg/ L 的培养基上 进行抗性植株生根筛选。 1. 2. 5 转基因植株 PCR 检测 在 Km 抗性培养基 中生根的烟草转化植株, 置 于 MS 培养基上 扩大繁 殖。从烟草叶片中提取植物总 DNA 进行 PCR 扩增 鉴定。DNA 的提 取按 Edwards 等 的小量 DNA 提 取 方法进行[ 6] 。以转化植株的 DNA 为模板, 未转化植 株作 阴 性对 照。用 npt II 基 因 的两 个 引物 5.- GCTATGACTGGGCACAACAG- 3 . 和 5 .-ATACCG-TAA AGCACGAGGAA- 3. 进行 PCR 扩增。扩 增 条 件 为: 94 e 、3 min, 94 e 、45 s, 56 e 、45 s, 72 e 、1 min, 35 个循环, 72 e 延伸 5 min, 预期扩增片段大小 为676 bp。 2 结果与分析 2. 1 叶盘大小对转化频率的影响
在上述烟草转化体系中, 叶盘的分化能力可长 达 30 d 左右, 每块叶盘上分化的再生芽总数可高达 40 株, 所以后期对假阳性植株的剔除工作量就非常 大。因此, 该实验在分化培养基中加入不同浓度的 Km, 来确定选择压的适宜浓度, 以便在早期获得较 高频率的阳性 植株。从表 2 可以看出, Km 浓度为 50 mg/ L 时, 分化率虽然较高, 但阳性植株频率约为 100 mg/ L 选择压时的一半。当 Km 浓度升高至 150 mg/ L 和 200 mg/ L 时, 会逐渐严重影响植株的分化。 综合比较, 用 Km 100 mg/ L 浓度筛选时, 有较高的植 株分化率和阳性植株频率, 从而被确定为烟草叶盘 转化 Km 最适选择压。 2. 5 转基因植株 PCR 鉴定结果
2农杆菌菌株和质粒试验用根癌农杆菌a2随着分子生物学和基因工程的飞速发展在许多未知基因功能的鉴定基因的各种调控元件如顺式调控元件反式作用因子等机理的研究中烟草往往被作为转基因的模式受体植物
甘肃农业科技 2004 年 第 9 期
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14( 3/ 10/ 30) 、水源 14 类 型感染中梁 17( 3/ 10/ 30) 、 Hy3( 4/ 40/ 100) 、条中 31 号 ( 4/ 25/ 100) 、混合 菌( 3/ 10/ 70) 均表现感染, 为中感品种, 但在大田具有成株 耐锈性。 4 适宜种植地区及栽培技术要点
冬小麦 新品系 90109( 13)- 1- 2- 1 适 宜在甘肃 东 部及陕北、宁夏彭阳等地推广种植。
烟草叶盘外植体在含有 Km 的分化选择培养基 上培养时, 叶盘首先会膨大, 可达原体积的一倍。培 养 21~ 28 d 后, 形成抗性愈伤组织和丛生芽。实验 结果表明, 叶盘若太大, 体积膨大时, 使得外植体的 各部位不能充分接触 Km 抗性培养基, 因而假阳性 转化植株出现的频率较高, 从而会加大后期的选择 工作量。而叶盘太小, 如 0. 5 cm @ 0. 5 cm 时, 分化