培养基优化设计

课程设计说明书
课程名称：新编生物工艺学
设计题目: 培养基优化设计
院系：生物与食品工程学院
学生姓名：
学号：2
专业班级：08生物技术
指导教师：关现军
2011 年6月3 日
课程设计任务书
目录
1.摘要················································页码
2.关键字··············································页码
3.设计背景············································页码
3.1培养基简介···········································页码
3.2培养基优化设计的重用意义····························页码
4 设计方案·················································页码 4.1原材料制备···········································页码 4.2菌种的选择···········································页码 4.3营养因子的比例设·····································页码4.4理化条件控制············································页码
4.5总工艺流程列叙········································页码
5 预期结果················································页码
6 方案实施时可能出现的问题与对策·······························页码
7 设计感受·················································页码
7.1 关于本方案···················································页码 7.2 关于自我·····················································页码8参考文献··················································页码
.
1 摘要
以改良ＭＲＳ发酵培养基为墓础，选择玉米浆、牛肉膏、乳糖、番茄汁、际蛋白陈等７个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化。

利用Ｌ8（２的7次方）正交实验，优化出培养墓营养因子最佳组成是：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％。

研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的ＭＲＳ培养基发酵液中，３７℃培养２０ｈ，菌落数均高于原ＭＲＳ培养基发酵液的菌落数，达到１护ｃｕｍＬ以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约４0％，同时使菌种数量达到最大。

2 关键字
乳酸菌，营养因子，优化培养，最大产菌
3. 设计背景
3.1乳酸菌培养基简介
乳酸菌工业产品为菌体本身细胞，因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要意义。

设计选用工业上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌种的适应期，利于增值。

乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂,影响生长的因素多,在实际工作中还应做其他条件的优化,如增菌液氧化还原电势、pH值、温度等,因工作量大而时间有限,只能对配方作初步的优化设计。

为了降低生产成本,在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物,在发酵罐内完成乳酸菌的增菌,罐内可以通入过滤除菌的N2和CO2 ,以降低反应液氧化还原电势(特别是保加利亚乳杆菌)。

若有自动化发酵罐还可通过监测pH值,发酵罐自动注入灭菌的1 mol - 1NaOH或NH4OH液,以中和代谢乳酸。

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。

有的
培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。

培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。

一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。

对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~6℃的冰箱内。

由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。

化学分类：天然培养基（指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。

如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等）；组合培养基（又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。

如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。

）；半组合培养基（指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。

例如，马铃薯蔗糖培养基。

）物理分类：液体培养基（一类呈液态的培养基。

）；固体培养基（一类外观呈固态的培养基。

根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。

）；半固体培养基（指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。

）；脱水培养基（又称预制干燥培养基，指含有除水分外的一切成分的商品培养基。

)
微生物分类：选择性培养基（一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。

）；鉴别培养基（一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。

例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB）。

）
另外一种就是天然培养基。

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。

组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。

但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。

目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

3.2存在问题
目前的培养基虽能进行乳酸菌生产，但是，其有操作复杂、产量小、资源浪费、成本过高等不足之处。

3.3培养基优化设计的重用意义
合理配置的培养基中各种营养物质成分达到最适比例，PH达到最适，溶解氧也达到
了最适浓度，这样就给微生物创造了最适宜生长的环境条件，并且对环境产生的污染降
到最低，实现了资源的循环利用。

又能单位时间内生长最多的菌量。

同时减少了动力设
备与加压设备，大大减少了成本，这对于一个生产企业来说无疑意义重大。

4.设计方案
4.1原材料制备
41.1 菌种
嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌及其混合菌，
4.1、2电子天平，酸度计，培养箱，电热恒温水浴锅，高压灭菌锅，放大镜冰箱
4.1，3玻璃仪器
试管、三角烧瓶、试剂瓶、刻度吸管、平皿等
4.1,4 实验室试剂浓度为1mol/L的NaOH，；体积分数为75％的乙醇；M17合成培养基、酸化MRS培养基；质量分数为10％脱脂乳液的配制：取150g脱脂奶粉，加入1350mL的蒸馏水中，配成10%的脱脂乳液，备用
4.2菌种的选择
4.2.1 酸奶的特征微生物菌落计数[9]及菌落形态将样品以十进制稀释后，取适当的稀释度分别接种，应用选择性培养基倒平板；MRS培养基，在37℃下培养72h，计算其保加利亚乳杆菌的菌落数；M17培养基，在37℃下培养48h，计算其嗜热链球菌的菌落数。

4.2.2 绘制球菌和杆菌及混合菌的发酵曲线
取已知含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌量的牛乳，在相同的温度下，各取1种单独培养，同时也使2种菌按一定的比例混合后培养，随着时间的变化分别测定其酸度值，然后绘制曲线，其操作步骤如下。

（1）取质量分数10%的脱脂乳液600mL，分装于3个烧瓶中，每个烧瓶装入200mL，于105℃下高温蒸汽灭菌15min。

（2）无菌室（超净台）中的分别接种。

取装有接种菌种牛乳的试管，摇匀里面的牛乳。

用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳1mL，注入1个烧瓶中，用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳10mL，注入第2个烧瓶中，然后，用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳0.5mL，同时用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳5mL，一起注入第3个烧瓶中，并均编号（3）将3个烧瓶密封，充分振摇，然后将其都放在42℃的培养箱中恒温培养。

每隔30min测定1次3个烧瓶中牛乳的酸度。

做出其酸度随时间变化的曲线。

【测定酸牛乳的酸度（吉尔涅尔度）】。

取10mL酸牛乳，用20mL的蒸馏水稀释，加入0.5mL体积分数为0.5%的酒精性酚酞指示剂，以浓度0.1mol/L的NaOH滴定，将消耗的NaOH体积（mL）数乘以10，即每100mL牛乳中所需要的浓度为0.1mol/L的NaOH的毫升数为1°T，称为1吉尔涅尔度。

一般牛乳的酸度超过20°T，即可认为该牛乳已开始变酸。

酸度越高，对热的稳定性越差，越易凝固。

由图1可得知，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌单独作为发酵剂时，它们在开始阶段的发酵速度比混合菌的快，其中，嗜热链球菌的发酵速度又较保加利亚乳杆菌快。

随着发酵时间的延长，嗜热链球菌的发酵速度开始减小，保加利亚乳杆菌的发酵的速度也开始减小，但混合菌的发酵速度逐渐加大，并且在2h后混合菌发酵牛乳的酸度分别超过杆菌的和球菌的，酸度明显提高；12h后，其酸度远远超过单菌的。

品尝酸奶时，发现混合菌发酵的酸奶口感更好.
有一上可知混合菌的发酵条件比单菌的更好更有价值，但如何搭配这两种菌使其得到更加优化的乳酸菌呢？现就设计不同比例的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵条件来得出使乳酸菌增菌的最佳混合菌的比例。

绘制不同比例的混合菌发酵曲线：
将菌种混合后，在相同的温度下培养，测定菌种的比例，并随着时间的变化分别测定其酸度值，然后绘制曲线，具体操作步骤如下。

（1）取配制好且灭菌的质量分数10%的脱脂牛乳1000mL，分装于5个烧瓶，每瓶200mL，分别接种。

第1个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.75mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳2.5mL；第2个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.5mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳5mL；第3个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.8 mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳2mL；第4个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.25mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳7.5mL；第5个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳0.6mL和含保加利亚乳杆菌的牛乳4mL。

分别标注发酵剂1号~5号。

（2）取接种牛乳的5个烧瓶，每瓶中分别倒出50mL于另一烧瓶中，编上号。

培养前，取装混合菌的5个烧瓶中的牛乳，用酸奶的特征微生物菌落计数法记数。

将接种的5瓶牛乳密封后，放在43℃的恒温培养箱里面培养。

将另5个烧瓶盖上塞子后，置于43℃的水浴锅中，每5min测定5个烧瓶里牛乳的酸度值。

（3）待到水浴锅中的烧瓶中的牛乳出现凝聚时，将恒温箱中对应的烧瓶取出，测定其酸度，之后置于4℃的冰箱中储存。

将菌种1和菌种2每隔一段时间从冰箱中取出后，倒出30mL测定其酸度，然后放回冰箱中继续储存。

4.3营养因子的比例设计
结果不同营养因子对嗜酸乳杆菌生长关系影响大小顺序为：玉米浆＞马铃薯汁＞牛肉膏＞乳糖＞际蛋白陈＞葡萄糖＞番茄汁＞帕拉金糖
1．3 正交试验
培养基中共取７个营养因子：牛肉膏、乳糖、番茄汁、马铃薯汁、葡萄糖、玉米浆、际蛋白胨
采用７个因子２个位级的正交表Ｌ8（２的7次方）设计试验，接种嗜酸乳杆菌采用二级发酵试验由７个因子的Ｒ值，得出它们作用的主次顺序为：玉米浆＞牛肉膏＞乳糖＞际蛋白陈＞马铃薯汁＞番茄汁＞葡萄糖，分析得到下表：
利用正交试验所优化培养基组成（即：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％，加其他盐），进步用３种乳酸菌进行发酵试验，验证培养基的发酵增菌效果并与ＭＲＳ培养基进行比较，分别接种３种乳酸菌，３7℃发酵培养２0ｈ，用平板计数法（无氧培养）进行检测，均进行３次发酵，测定发酵液菌落数，结果见表
4.4理化条件的控制
1、温度
温度是影响微生物生长的最重要因素之一。

从微生物整体来看：生长的温度范围一般在-10 ℃ ~100 ℃极端下限为-30 ℃，极端上限为105~300 ℃.微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度≠ 发酵速度快、积累代谢产物多。

一般而言，老龄比幼龄耐热，原核生物比真核生物耐热，非光合生物比光合生物耐热，结构简单的比结构复杂的耐热，在富含蛋白质的培养基上生长的细菌耐热能力强。

最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。

选择最适温度应该考虑微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度。

最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。

在各种微生物的培养过程中，各个发酵阶段的最适温度的选择是从各方面综合进行考虑确定的。

例如，在四环素发酵中，采用变温控制，在中后期保持较低的温度，以延长抗生素分泌期，放罐前24h提高2—3℃培养，能使最后24h的发酵单位提高50％以上。

又如，青霉素发酵最初5h维持30℃，6-35h 为25℃，36--85h为20℃，最后40h再升到25℃。

采用这种变温培养比25℃恒温培养的青霉素产量提高14．7％。

2．pH值的影响
微生物的生长pH值范围极广，从pH<2~>8都有微生物能生长。

但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。

同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。

在发酵工业中，控制pH值尤其重要,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。

微生物生长最适pH与产物形成最适pH相互关系的四种情况。

第一种情况是菌体的比生长速率(μ)和产物的比生产速率(Qp)都有一个相似的并且较宽的最适pH范围；第二种是Qp(或μ)的最适pH范围很窄，而μ(或Qp)的范围较宽；第三种是μ和Qp有相同的最适pH范围，但范围很窄，即对pH值的变化敏感；第四种，μ和Qp都有各自的最适pH范围。

属于第一种情况的发酵过程比较易于控制，第二、三模式的发酵pH须要严格控制，最后一种情况应该分别严格控制各自的最适pH。

选择最适pH的原则是既有利于菌体的生长繁殖，又可以最大限度地获得高的产量。

一般最适pH是根据实验结果来确定的，通常将发酵培养基调节成不同的起始pH值，在发酵过程中定时测定、并不断调节pH，以维持其起始pH值，或者利用缓冲剂来维持发酵液的pH。

同时观察菌体的生长情况，菌体生长达到最大值的pH即为菌体生长的最适pH。

产物形成的最适pH也可以如此测得。

只有在最适pH下菌种才能生长才能达到
最大菌种产量。

3．溶解氧的影响
溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。

由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度亦如此，因此，需要不断通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。

溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。

如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。

需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。

溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成，但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。

因为，为避免发酵处于限氧条件下，需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度，并使发酵过程保持在最适浓度。

最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关，这是由实验来确定的.
4.5总工艺流程列叙
工艺流程：培养嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌→对数期接种→将菌种放在MRS培养基培养→接种在三个烧瓶里中→改变营养因子条件→改变理化控制条件→37°C下培养72小时→无菌室中接种→分装试管中→分别滴加含嗜热链球菌的牛乳1mL→编号密封→测定菌种含量→比较方差分析→得到最产量最大的培养基配方与理化条件。

5. 预期结果
结果表明优化后的培养基利用的营养因子为：玉米浆３％、牛肉膏１％、乳糖１％原ＭＲＳ培养基的营养因子配比为：蛋白陈１％，牛肉膏１％，乳糖１％，葡萄糖１％，番茄汁１％，其中际蛋白陈价格昂贵（零售价格约１０元／ｋｇ），而优化后培养基的主要营养因子为玉米浆其为生产玉米蛋白的副产品，价格低廉（价格约５一６元／kg），进行酸处理后成本也不过７一８元／ｋｇ。

因此，优化后的ＭＲＳ培养基成本降低约４％，大大降低了成本。

研究结果表明，嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳酸菌，在优化后的ＭＲＳ培养基发酵液中，３７℃培养２０ｈ，菌落数均高于原ＭＲＳ培养基发酵液的菌落数，达到１护ｃｕｍＬ以上，乳酸菌发酵液得到了浓缩，大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本，原料成本降低了约４0％，同时使菌种数量达到最大。

6 方案实施时可能出现的问题与对策
（1）配料的R值因子,是影响乳酸菌生长浓度的主要因素。

（2）微生物的生长pH值范围极广，从pH<2~>8都有微生物能生长。

但是绝大多数种类都生活在pH5.0~9.0之间。

7、设计感受
7.1.关于本方案
通过正交试验优化了乳酸菌发酵培养基,用价格低廉的原料(如玉米浆等)代替了价格昂贵的原料(如际蛋白陈),用其发酵嗜酸乳杆菌,嗜热链球菌,保加利亚乳杆菌等,发酵液中菌落数均高于原MRS培养基发酵液的菌落数,达到109.fu/mL以上,取得了较好的效果,大大降低了乳酸菌的发酵成本,对乳酸菌保健食品的开发具有实际意义。

7.2.关于自我
这是大学阶段我第一次深入地对工厂加工工序进行设计，刚开始还感觉无从下手，可在我们小组的讨论分工下，慢慢就有了思路，团结的力量就是很伟大，这无形中培养了我们的团队观念和合作意识。

通过自己筛选课题然后查资料解决问题，感觉对我动手解决问题能力的提高很有帮助。

不过我发现自己知识真是太少了，生物专业知识不踏实，我必须努力学习，不然毕业后进工厂只能做力气活。

同时我明白了科学实验必须有严谨的作风，端正的态度，扎实的专业知识和充分的准备，所以现在大学生的我们要努力用知识武装头脑，为不久的将来投入社会打下坚实的基础。

总而言之，通过本次的课程设计使我获益匪浅，学到了很多书本上学不到的知识，更重要的是使我的语言表达能力得到很大程度提升。

最后再一次诚挚的感谢所有在设计中帮助过我的良师益友和亲爱的同学们。

8参考文献
【1】徐中儒.农业试验最优回归设计. 北京:农业出版社,1988
【2】贵州农学院. 生物统计附试验设计. 北京:农业出版社,1983
【3】刘忠敏，林兴兵，杨生玉. 现代应用生物技术. 北京：化学工业出版社， 2004 【4】陶兴元，刘志国，田俊. 生物工程概论. 北京：化学工业出版社，2005 【5】诸葛健，沈微. 工业微生物育种. 北京：化学工业出版社，2006
【6】鲍新华. 生物工程. 北京：化学工业出版社，2008。