成年SD大鼠糖尿病心肌病模型的建立

成年SD大鼠糖尿病心肌病模型的建立
目的探索成年SD大鼠糖尿病心肌病（DCM）模型建立的方法。

方法20只健康SD成年大鼠作随机分为DCM组（n=10）、对照组（n=10）。

对照组喂养普通饲料，DCM组高脂饲料喂养12周。

DCM模型的建立：对照组以枸橼酸缓冲液腹腔注射，DCM组使用等量1%链脲菌素腹腔注射。

通过病理组织学证实为DCM心肌病理学改变。

结果与对照组比较，DCM组的血清FBG、TC、LDL-C、TG均明显增高（P＜0.05），而对照组的血清HDL-C较DCM组高（P ＜0.05）。

与对照组比较，DCM组的大鼠心肌细胞排列紊乱，间质基质集聚与纤维化增多。

第6周末，两组的空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），DCM组的IRI、胰岛素均高于对照组（P＜0.05）。

结论高脂、高糖膳食并小剂量STZ腹腔注射建立DCM模型，其方法成功率高，简单易行。

[Abstract] Objective To explore the method how to establish of adult Spprague-dawley rat model of diabetic cardiomyopathy （DCM）. Methods 20 healthy adult Spprague-dawley rats were randomly divided into the DCM group （n=10）and the control group （n=10）.Rats in the control group and DCM group was respectively fed with normal rat diet and high fat diet persistently 12 weeks.STZ was applied in the DCM group to make the rat DCM model by intraperitoneal injection，and the same dosage of citric acid buffer were used to the the control group by the same way.The myocardial pathological alteration of DCM was identified in the DCM group by histopathology. Results Compared with the control group，fasting blood glucose （FBG），low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C），the serum total cholesterol （TC），and triglyeride （TG）of rats in the DCM group were higher （P＜0.05），the serum High-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）in the control group was higer than that in the DCM group （P＜0.05）.Compared with the control group，rat myocardial cells of the DCM group arranged in disorder，interstitial matrix accumulation and fibrosis increased.At the end of 6th week，there was no statistical difference of fasting blood glucose in the two groups （P>0.05），but insulin and insulin resistance index in the DDM group were higher （P＜0.05）. Conclusion Establishment of DCM model by intraperitoneal injection of small dose of Streptozotocin was easily with high-fat and hige-sugar diet.The method has high successful rate，and it is simple and easy.
[Key words] Diabetic cardiomyopathy；Spprague-dawley rat model；Streptozotocin
近年来，中国糖尿病的发病率迅速上升，糖尿病前期患者高达1.48亿，糖尿病患者达9240万，防控形势严峻[1]。

目前认为，糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）较易导致严重心律失常和心力衰竭，是一种特异性心肌病。

Hamby等在1974年首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起肌代谢紊乱，心肌纤维化和心脏微血管病变等所致的心肌广泛结构异常，引起左心室肥大、舒张期和（或）收缩期功能障碍的一种疾病[2]，本实验通过探索DCM模型建立的
方法，为研究其发病机制及防治措施提供可靠的实验理论依据。

1 材料与方法
1.1 药品与试剂
胰岛素检测试剂盒及链脲菌素（streptozotocin，STZ）购于美国Sigma公司；枸橼酸，枸橼酸三钠购于北京化学试剂出品厂；葡萄糖试剂盒由上海荣盛生物科技公司提供；血脂检测盒由南京建成生物研究所提供。

1.2 主要仪器
超低温冰箱（MDF-382E，SANYO，Japan）；Millipore超纯水仪（Elix3/Mini-QBicel，Millipore，USA）；微量移液器（1000 μl/100 μl/10 μl，Eppendorf公司）；低速离心机（Centrifuge 5702，Eppendorf，Germany）；全自动生化分析仪（Hitach-7060，日立公司，Japan）；体视显微镜（S8APO，LEICA，Germany）；光学摄像系统（AX-70型，Olympus，Japan）；超声震荡器（JG-4301，天津精工医疗设备公司，China）。

1.3造模方法
按照董世芬等[3-4]报道的方法建立DCM模型。

将20只健康SD大鼠随机分成DCM组（n=10），对照组（n=10），DCM组以高脂饮食喂养（59.5%基础饲料，0.5%胆固醇，10%蛋黄粉，10%猪油和20%蔗糖），对照组始终以普通饲料喂养。

喂养至第6周，DCM组以1% STZ 30 mg/kg腹腔注射，对照组以同体积枸橼酸缓冲液腹腔注射。

72 h后取尾静脉血测量空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L判定为2型糖尿病。

造模结束后，对照组普通饲料喂养6周，DCM组高脂、高糖喂养6周。

1.4 SD大鼠左心室心肌病理切片制作
1.4.1 心室心肌HE染色SD大鼠断颈处死，快速取出心脏，以10%甲醛固定24 h，用硬蜡包埋。

切片厚度4 μm，连续切片。

苏木素染色6～16 min，经水冲洗，酒精盐酸分化。

分化水洗以后，用温水蓝化后，流水冲洗6 min以上，伊红复染（5～20 s）。

低浓度乙醇到高浓度乙醇切片脱水，80%乙醇1次（3～5 min/次），95%乙醇2次（3～5 min/次），100%乙醇2次（10 min/次），二甲苯2次，树胶封片。

1.4.2 左心室心肌病变的观察在BX60型光学显微镜下，放大100、200、400倍分别观察HE染色左心室心肌病变。

1.5 血脂、血糖水平测定
全自动生化分析仪Hitach-7060测定血脂水平，包括LDL-C、HDL-C、TC、TG。

TC、TG和BG采用常规酶法，HDL-C和LDL-C采用直接法。

1.6 大鼠胰岛素、胰岛素抵抗指数的测定
用Sigma公司的胰岛素试剂盒测定胰岛素，胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，IRI）等相关指标。

1.7 统计学处理
利用SPSS 19.0统计软件处理数据，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 DCM模型的建立
DCM组高脂饲料喂养6周后，两组的空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），但DCM组的IRI、胰岛素均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

第7周时给予STZ腹腔注射，3 d后测空腹血糖，1只未达标；3 d后给予腹腔补注射STZ后，测尾部空腹血糖>11.1 mmol/L，喂养12周，大鼠无死亡，成功率为100%。

对照组用等量枸橼酸缓冲液腹腔注射作为对照，血糖均正常，12周时无死亡。

2.2 DCM的血糖、血脂评价
与对照组比较，第12周时，DCM组的血清FBG、TG、TC、LDL-C均明显增高，HDL-C低于对照组（P＜0.05）（表2）。

膳食诱导0周时，高脂、高糖饮食6周后，两组的空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05），DCM组腹腔注射STZ并继续高脂、高糖饮食至12周后，DCM 组的血糖水平高于对照组（P＜0.05）（表3）。

2.3 病理切片结果观察
两组随机各抽取两只大鼠作病理，结果可见：对照组的心肌纤维排列整齐，细胞间隙正常，胞质丰富，可见横纹（图1）。

DCM组的心肌细胞排列紊乱，形态扭曲，呈空泡状，部分心肌纤维坏死，断裂，纤维组织替代坏死心肌，符合DCM心肌病理变化（图2）。

3 讨论
近年来，糖尿病的患病率迅速增高，在发展中国家，糖尿病已发展成为临床的主要代谢性疾病，其导致的心血管并发症严重威胁人们的健康[5]。

Hamby等在1974年首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起肌代谢紊乱，心肌纤维化和心脏微血管病变等所致的心肌广泛结构异常，引起左心室肥大、舒张期和（或）收缩期功能障碍的一种疾病。

迄今的研究证据表明，有一部分糖尿病患者出现
心力衰竭由DCM所致[2，6-7]，DCM的发病机制复杂，目前尚无特效治疗。

本实验旨在探索DCM模型建立的方法，为研究其发病机制提供及防治措施提供可靠的实验理论依据。

SD大鼠容易饲养，疾病抵抗力强，经济实惠，容易获得，是常用的实验动物。

本实验以SD大鼠为研究对象建立DCM模型。

建立DCM模型的方法主要有以下几种。

①1型糖尿病模型的建立：禁食12 h，大鼠一次性腹腔注射STZ（60 mg/kg），72 h后随机血糖≥16.67 mmol/L判定为模型大鼠[8]；②2型糖尿病模型的建立：大鼠适应1周后，高糖、高脂饮食4～6周，禁食12 h后，给予腹腔注射STZ 30 mg/kg，3 d后随机血糖≥16.67 mmol/L或者空腹血糖≥11.1 mmol/L判定为为造模成功[3，9]。

国外文献报道还有2种2型糖尿病模型建立方法。

①转基因小鼠：如zucker糖尿病肥胖小鼠，ob/ob肥胖小鼠，db/db糖尿病小鼠等[10-12]；
②单纯高脂饲料喂养建立模型：脂喂养C57BC/6小鼠，可出现代谢障碍及心功能障碍，直到20周后才出现血糖升高，建模周期较长，并且与糖尿病状态有些差异[13-14]。

单纯高脂、高糖喂养模型不能成功，转基因小鼠实验条件要求高，价格昂贵，本实验采用高糖、高脂喂养后，小剂量STZ腹腔注射成功建立DCM 模型。

2型糖尿病以代谢紊乱和胰岛素抵抗为特征[15]。

代谢紊乱主要包括：高血糖与脂肪酸升高。

本实验结果显示，膳食诱导0周时，两组的空腹血糖差异无统计学意义，高脂、高糖饮食6周后，两组的空腹血糖差异无统计学意义，但DCM组的IRI、胰岛素较对照组明显升高，造成了胰岛素抵抗。

DCM组小剂量腹腔注射STZ后，3 d后血糖开始升高，形成糖尿病状态，高糖、高脂继续喂养到12周，血糖升高明显。

第12周DCM组的血清TG、TC、LDL-C均明显增高，HDL-C低于对照组。

以上结果表明，高糖、高脂膳食可造成大鼠胰岛素抵抗，脂代谢紊乱，但是不能使血糖升高，但注射STZ后大鼠出现糖尿病状态。

DCM 可表现为两种类型：限制性心肌病与扩张型心肌病，早期表现为限制性心肌病，主要为舒张功能不全，晚期扩张型心肌病多见，表现为左室肥厚，左室扩大，左室舒张末压增高，收缩功能受损。

有文献报道[16-17]：DCM的病理形态特征为，显微镜下可见单个或多个心肌细胞呈凝固性坏死，伴有少许浆细胞浸润或淋巴细胞，纤维组织替代坏死的心肌细胞。

本实验病理切片与文献报道基本一致，有利于判定造模成功。

综上所述，高脂、高糖膳食并小剂量STZ腹腔注射是目前建立2型糖尿病的主要方法，简单易行，成功率高，为研究DCM的发病机制及临床防治提供了理论基础。

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