高效液相色谱法测定饲料中环丙氨嗪的含量

高效液相色谱法测定饲料中环丙氨嗪的含量
周灿谭美英杨彦宁张港关静渊
魏唯周玉洁张瑞祺隆雪明*
(湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006)
摘要：本实验建立饲料中环丙氨嗪含量的分析方法。

试样采用1%三氯乙酸/乙腈（20:80）溶液提取，经MCX 固相萃取柱净化，采用磷酸缓冲盐+甲醇+乙腈（93:5:2）为流动相洗脱，C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）分离，在检测波长214nm下进行测定，外标法定量。

在浓度0.2-50.0mg/L范围内线性关系良好（R≥0.999），在0.5μg/kg、5μg/kg和50μg/kg添加水平下，平均回收率为75.3%-97.9%，相对标准偏差均少于10%，方法定量限0.5mg/kg。

该方法灵敏、简单、重复性好，适用于饲料中环丙氨嗪的测定。

关键词：高效液相色谱法；饲料；环丙氨嗪
1概述
环丙氨嗪（Cyromazine，Cyr）又名灭蝇胺，其化学名为2-环丙氨基-4，6-二氨基三嗪，结构式如图1所示，属三嗪类化合物[1-2]，是一种高效抑制昆虫生长剂类杀虫剂，抑制蝇类幼虫的生长发育和羽化，1994年获农业部批准作为杀虫剂在我国上市。

2002年农业部将环丙氨嗪批准为三类新兽药。

近年来，为改善畜禽养殖场环境卫生，许多养殖户把环丙氨嗪长期应用于产蛋期饲料和肥育猪饲料中而没有休药期，易造成鸡蛋、奶和肉等动物性产品中的药物残留[3]。

环丙氨嗪被认定为具有潜在致癌性的化合物，同时研究发现环丙氨嗪在环境中具一定的迁移性，且在土壤中比较稳定，土壤中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对
基金项目:《兽药饲料中非法添加物快速筛查方法学研究与应用》（2022JJ90055）*通信作者
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不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患[4]。

目前测定环丙氨嗪药物的检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法[5-6]
和质谱法[7]。

暂无饲料中环丙氨嗪的检测方法。

本文拟建立一种利用高效液相色谱法快速测定饲料中环丙氨嗪的方法，为有效监控饲料中环丙氨嗪药物提供简便、快速、
高效的检测方法，杜绝动物源性食品潜在风险产生，保障食品安全。

2材料与方法
高效液相色谱仪
（配紫外或二极管阵列检测器），电子分析天平，离心机（带有50mL 离心管），振荡器，
固相萃取装置，氮吹仪，0.22μm 微孔滤膜。

环丙氨嗪标准品，
甲醇和乙腈为色谱纯，实验用水为符合GB/T 6682规定的一级水，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、三氯乙酸、
甲酸、氨水均为分析纯，MCX(60mg/3cc)。

2.3.1
标准溶液的配制
准确称取环丙氨嗪标准品50mg （精确到
0.01mg ）于50mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释
至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL 的标准储备液。

分别吸取适量环丙氨嗪标准储备液，用流动相稀释成质量浓度为0.2μg/mL 、0.5μg/mL 、1.0μg/mL 、2.0μg/mL 、5.0μg/mL 、10.0μg/mL 和50.0μg/mL 的标准曲线工作液。

2.3.2
提取
称取饲料样品2.0g(精确到0.001g)，加入10
mL 1%三氯乙酸/乙腈（20∶80）溶液涡旋摇匀，振荡
提取5min ，5000r/min 离心5min ，取上清液。

重复提取一次，合并取上清液，混匀得到待净化液。

2.3.3净化
将MCX 固相萃取柱依次用甲醇3mL 、水
3mL 活化，取待净化液5mL 上样，依次用2%甲酸水、甲醇各3mL 淋洗，挤干，用5%氨化甲醇3mL 洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹至近干，用1.00mL 流动相复溶，涡旋混匀，过0.22μm 微孔滤膜，供液相色谱分析。

2.3.4色谱条件
色谱柱：C18柱(4.6×250mm ，5μm)；流动
相：磷酸盐缓冲液+甲醇+乙腈占比分别为93+5+2；
流速：1.0mL/min ；检测波长：214nm ；进样量：20μL 。

3
结果与分析
环丙氨嗪含有2个氨基和1个环丙氨基，为碱性化合物，微溶于水，略溶于甲醇和乙醇。

常用于提取环丙氨嗪药物的溶剂有1%三氯乙酸[8]、1%三氯乙酸/乙腈[9]、氨化乙腈[10]等，本研究根据环丙氨嗪的特性并结合相关报道比较了不同的提取溶剂,研究发现20%氨化乙腈与20%三氯乙酸/乙腈提取饲料的回收率得到明显提升，但由于氨化乙腈需进一步处理，且在吹干时发现部分脂溶性物质难以吹干，故试验选取1%三氯乙酸/乙腈（20:
80）溶液作为提取试剂。

环丙氨嗪为碱性化合物，试验中比较了HLB 、
MCX 、
SCX 不同小柱净化效果，发现HLB 净化效果一般，MCX 与SCX 柱净化效果较好，能有效去掉杂质干扰。

考虑到市场中SCX 柱规格与型号较少，本文最终选用现在使用较多的MCX。

3.2.1检测波长的确定
根据国内外文献报道
[11-12]
和《中国兽药典》
2020年版，在检测动物组织、蔬菜、饲料时最常用的检测方法是紫外检测器，其检测波长主要有214nm
图1环丙氨嗪的结构式
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和230nm 。

为确定最佳波长，本试验进行了不同波长测定，发现在214nm 下响应是230nm 波长下响应的3倍左右（光谱图见图2，色谱图见图3），且目标物附近杂质差异不大，因而选用214nm 作为本研究的检出波长。

3.2.2流动相的选择
液相色谱系统中流动相的选择起着极为关键
的作用，它决定着目标分析物的分离程度。

相关资料显示，蔬菜中环丙氨嗪色谱条件采用氨基柱，乙腈-水溶液（97:3）洗脱测定[13]；动物性食品中环丙氨嗪的色谱条件采用亲水反应离子交换色谱柱，乙酸铵-乙腈溶液流动相等度洗脱或梯度洗脱测定[11,14]；兽药质量标准（2017年）采用C18色谱柱，流动相有磷酸缓冲盐-甲醇-乙腈（93:5:2）和水-甲醇-乙醇胺（76:24:0.1）
洗脱测定。

本文比较了不同流动相与色谱柱的影响。

考虑到C18为常用色谱柱，且峰型较好，本文选用磷酸缓冲盐-甲醇-乙腈
为流动相，色谱中常用的C18作为方法的色谱柱。

3.3.1以配合饲料、浓缩料、预混合饲料为基质，添
加适量环丙氨嗪标准工作液进行试验，考察方法的定量限。

以信噪比≥10为定量限，确定方法定量限为0.5mg/kg ，色谱图见图4。

由于环丙氨嗪是允许使用的药物，推荐使用量为5mg/kg ，本方法的定量限，能满足实际样品检测的需要。

3.3.2标准曲线
以色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横
坐标，环丙氨嗪药物在浓度0.2-50.0mg/L 范围内
色谱峰面积与浓度呈线性相关，其回归方程和相关系数见表1，准曲线图谱见图5。

3.3.3方法的准确度、精密度与适用范围
为考察本检测方法的准确度、精密度与适用
范围，进行了添加回收试验。

设0.5mg/kg 、5.0mg/kg 、50mg/kg 三个浓度水平，在空白饲料中添加标准工作液，每个水平设五个平行，并设空白对照。

分别称取饲料2.0g ，添加一定体积的标准工作液，混匀，静置40min ，按样品前处理方法处理后进行分析，根据各组的峰面积计算其浓度和回收率。

添加回收试验结果见表2，环丙氨嗪标准色谱图见图6。

从回收率结果看出，配合饲料、浓缩料、预混
合饲料在0.5-50
mg/kg 添加浓度范围内，平均回
图2
环丙氨嗪的扫描光谱图
图3环丙氨嗪在波长214nm 和230nm 的色谱图
图4配合饲料的定量限色谱图
表1环丙氨嗪标准曲线线性方程及回归系数
线性范围/（mg ·L -1）
曲线方程相关系数0.2-50
Y =2.69×105X +6×104
0.9999
图5
环丙氨嗪标准曲线图
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收率为78.3%-94.7%，批间相对标准偏差（RSD ）在1.29%-8.73%之间，表明该方法稳定性、重现性好，能满足饲料中环丙氨嗪药物检测分析的要求。

4结论
本实验通过对前处理条件和液相色谱条件的
优化，建立了利用高效液相色谱法测定饲料中环丙氨嗪含量的方法。

该方法灵敏、简单、重复性好，适用于饲料中环丙氨嗪的测定。

参考文献
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表2
饲料中环丙氨嗪检测的准确度和精密度
添加水平/（mg ·kg -1）
预混料
浓缩料
配合料
回收率/%批间变异系数/%
回收率/%批间变异系数/%
回收率/%批间变异系数/%
0.578.3 3.1387.48.7386.1 6.095.0
91.8 5.2793.9 3.0494.7 3.0250.089.7
2.73
89.9
1.29
89.6
6.48
图6
环丙氨嗪标准溶液色谱图（1.0mg/L ）
37。