纤维素酶酶活的测定方法

检测分析
纤维素酶酶活的测定方法
河南省科学院生物研究所 刘德海　杨玉华　安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽
饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。

纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。

据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。

下面就此两种方法作一介绍。

1　C MC(羧甲基纤维素)法
1.1　材料
1.1.1　饲用纤维素酶　由河南省科学院生物研究所提供。

1.1.2　试剂　磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。

1.1.3　仪器　721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。

1.1.4　试剂配制
1.1.4.1　pH5.0柠檬酸缓冲液　制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取
2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。

1.1.4.2　羧甲基纤维素溶液　准确称取
2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。

1.1.4.3　3,5-二硝基水杨酸显色液　准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(18
2.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。

1.1.4.4　0.1%标准葡萄糖溶液　准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。

1.2　标准曲线的绘制　分别吸取0.1%标准葡萄糖溶液
2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分别定容至50mL。

再分别吸取上述溶液各2.5mL于试管中,各加2.5mL3,5-二硝基水杨酸,煮沸5min (另作1管对照,取2.5mL蒸馏水,加2.5mL3,5 -二硝基水杨酸,同样煮沸5min)。

冷却后,用721型分光光度计在530nm波长下比色,记录各管的光密度值,以光密度作纵座标,对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横座标,绘制标准曲线。

1.3　测定方法　通过“四分法”精确称取酶样品
2.00g,加温水90mL、柠檬酸缓冲液10mL,40℃浸提1h,以脱脂棉过滤备用。

根据酶活高低,上述酶液需适当稀释使其产生的还原糖在100～500μg之间,光密度在0.1～0.6。

取1支小试管(15mm×150mm),加羧甲基纤维素钠溶液2.0mL,于50℃水浴中预热2～3 min,加稀释酶液0.5mL,保温30min,取出加入3, 5-二硝基水杨酸2.5mL,沸水浴煮沸5min,冷却后用分光光度计530nm处比色测定OD值。

另取小试管加羧甲基纤维素钠2.0mL,先加入2.5mL3,5-二硝基水杨酸,再加酶液0.5mL,其他操作同样品测定作空白测定。

1.4　结果计算
CMC酶活力=
B×n
0.5
mg/g·30′·50℃
式中:B—从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数(mg);n—酶液稀释倍数;0.5—测定时吸取稀释酶液毫升数(mL)。

2　滤纸法
2.1　材料
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2002年第17期 中国饲料
2.1.1　试剂　醋酸钠(AR )、冰醋酸(AR )、甲苯(AR )、氢氧化钠(AR )、酒石酸钾钠(AR )、苯酚(AR )、亚硫酸钠(AR )、3,5-二硝基水杨酸(AR )、新华5号滤纸(剪成1cm ×3c m 纸条)。

2.1.2　仪器　同CMC 法。

2.1.3　试剂配制
2.1.
3.1　0.1mol /L pH
4.6醋酸—醋酸钠缓冲液　准确称取醋酸钠(CH 3COONa ·3H 2O )6.70g 和冰醋酸2.60mL ,以蒸馏水溶解,定容至1000mL 。

2.1.3.2　3,5-二硝基水杨酸显色液　配制同CMC 法。

2.2　标准曲线绘制　同C MC 法。

2.3　测定方法　酶液制备同C MC 法。

样品测定方法为:准确吸取4mL 酶液和1mL 缓冲液于试管中,加入新华5号滤纸条一条,滴入甲苯2～3滴防腐,40℃静止反应24h 。

吸取滤纸酶解液1mL ,加蒸馏水1.5mL 、3,5-二硝基水杨酸溶液2.5mL 于试管中,沸水浴煮沸5min ,冷却后在530nm 处比色测定光密度OD 值。

吸取4mL 蒸馏水代替4mL 酶液,其他操作
同样品测定作空白测定。

2.4　结果计算
滤纸酶活力(FB )=B ×n
45
×1mg /g ·24h ·40℃
式中:B ———从标准曲线上查得的净葡萄糖毫克数(mg );n ———酶液稀释倍数;45———5mL 反应液中含4mL 酶液;1———吸取1mL 酶解液进行测定。

3　讨论
作为底物的羧甲基纤维素钠,用不同厂家生产的滤纸测定酶活时,结果不尽相同,有时相差还较大。

因此,得出酶活力结论时应注明底物产地。

纤维素酶是一种微生物活性制剂,对温度、酸碱度十分敏感,不同菌株生产的纤维素酶最适pH 值、最佳作用温度有所不同,测定方法有待进一步探讨。

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28—中国饲料 2002年第17期。