土壤酶测定方法

土壤磷酸酶（酸性）——磷酸苯二钠比色法
（一）试剂
1.pH5 醋酸盐缓冲液：
A:L 醋酸溶液（稀释至1000ml）
B:L 醋酸钠溶液 A 液+B液稀释至 100ml
若使用无水乙酸及乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算以下：
①无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为，则需无水乙酸的体积为×1000/=（毫升）；②乙酸钠用量的计算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为×82× 1=11（克）。

使用无水乙酸及
乙酸钠配制 1 升PH为的乙酸盐缓冲液的方法以下：用量筒量取毫升无水乙酸至1000 毫升烧杯内，再用
台秤称取无水乙酸钠11 克至该烧杯，而后用量筒量取=996 毫升蒸馏水至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并呈平均的溶液即为1 升PH为的乙酸 - 乙酸钠缓冲液。

或许：量 7ml 醋酸钠液 +3ml 醋酸液混淆即得。

2.% 磷酸苯二钠： pH5醋酸缓冲液
3.氯代二溴对苯醌亚胺：称取 2 ，6- 二溴苯醌氯酰亚胺，用 10ml 96%乙醇（48ml 乙醇 +2ml 水）溶解，储存于棕色瓶中，寄存在冰箱中，保留的黄色溶液未变褐
色以前均可使用。

4.酚标准溶液：酚原液 --- 取 1g 苯酚溶于蒸馏水中，定容至 1000ml 水中，保留于棕色瓶中。

酚工作液 --- 取 10 ml 酚原液稀释至 1000ml 水中，每毫升含酚
5.甲苯
硫酸铝溶液，称取硫酸铝，定容至100ml。

（二）实验步骤
1.标线制作
取 0，1， 3，5，7，9，11，13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，加入5ml 缓冲液和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min 后比色测定。

以光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

2.样品测定
称取风干土样（过 20 目筛，去除杂质），搁置于 200ml 容量瓶（离心管）中，加甲苯，轻摇 15min 后，加入 20ml %磷酸苯二钠，认真摇匀后搁置于 37°C恒温箱中
培育 24h，后于培育液中加入 %硫酸铝溶液过滤。

汲取滤液 3ml 于 50ml 比色管中，按标准曲线方法显色，于波长 578nm处测定颜色的深度，读取吸光值。

对每一土样，设置用10mL水取代磷酸苯二钠基质的比较。

并作空白无土比较。

（三）数据计算
以 24 小时每克土壤中开释出的酚的毫克数表示。

土壤脲酶活性测定：——靛酚比色法
试验步骤：试剂： 1）甲苯
2）10%尿素：称取 10g 尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（）：184 克柠檬酸和克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液归并，用 1mol/L NaOH 将 PH调至，用水稀释至 1000 毫升。

4）苯酚钠溶液（ L）：
A：克苯酚溶于少许乙醇，加 2 毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至100 毫升，
存于冰箱中；
B：27 克 NaOH溶于 100 毫升水，存于冰箱中。

将 AB溶液保留在冰箱中。

使用前将 2 溶液各 20 毫升混淆，用蒸馏水稀释至100毫升备用。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳固。

如购置的溶液是含10%活性氯的，则计算以下：10%*原液体积（配100ml）=%（100ml+需加水）
6）氮的标准溶液： a 精准称取克硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml，获得 1ml 含有氮
的标准液
标准曲线绘制：汲取配置好的氮溶液 10ml，加蒸馏水定容至 100ml，汲取稀释的
标准液 1， 3， 5， 7，9，11，13ml，移至 50ml 容量瓶，加蒸馏水至 20ml，再加
入 4ml 苯酚钠，认真混淆，加入 3ml 次氯酸钠，充足摇荡，搁置 20 分钟后显色 , 用水稀释至刻度。

1h 内将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

1) 称取 10g（5g）过 20 目筛的风干土样于 100ml（50ml）三角瓶中。

2) 向容量瓶中加入 2ml（1ml）甲苯（以能所有使土样润湿为度）并搁置15 分钟。

3)以后加入 20ml （10ml）10％尿素溶液和 40ml（ 20ml）柠檬酸缓冲液（），并
认真混淆。

4)将容量瓶放入 37 摄氏度恒温箱中，培育 24h
5)培育结束后，用热至38 摄氏度水稀释至刻度，认真摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。

与此同时 , 进行以水取代基质 (10ml 10%尿素用 10ml 蒸馏水取代 ), 及无土比较测定。

6)显色：汲取 3ml 滤液于 50ml 容量瓶中，加入 20ml（ 10ml）蒸馏水，充足震荡，而后加入 4ml 苯酚钠，认真混淆，再加入 3ml 次氯酸钠，充足摇荡，搁置 20 分钟，用水稀释至刻度，溶液体现靛酚的蓝色。

7)1h 内在（靛酚的蓝色在 1h 内保持稳固）在分光光度计上用 1cm液槽，于 578nm 处将显色液进行比色测定。

8)无土比较：不加土样，其余操作与样品实验同样。

以查验试剂纯度，整个实
验设置一个比较。

9)无基质比较：以等体积的水取代基质，其余操作与样品实验同样。

每个土样都
设此比较。

结果计算：土壤脲酶活性以24 小时后 100g 土壤中 NH3－ N 的毫克数表示。

M＝（ X 样品－ X 无土－ X 无基质） *100*10
式中： M－土壤脲酶活性值
X 样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－ N毫克数
X 无土――无土比较实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－ N 毫克数
X 无基质――无基质比较实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N 毫克数
100 ――样品定容的体积与测准时汲取量的比值
10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值
若土壤脲酶活性以24 小时后 100g 土壤中 NH3－N 的毫克数表示的话，计算以下：
M=a*2
a――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－ N 毫克数。

2——换算成1g 土的系数。

土壤蔗糖复原酶测定方法
酶促反响试剂：
1)8%蔗糖溶液：称取 8g 蔗糖溶解，定容至 100ml。

2)磷酸缓冲液： 1/15M 磷酸氢二钠（· 2H2O溶于 1L 蒸馏水）加 1/15M 磷酸二
氢钾（KH2PO4溶于 1L 蒸馏水中）即成。

3）甲苯
4)3,5- 二硝基水杨酸试剂 (DNS 试剂 ): 称二硝基水杨酸 , 溶于 20ml 2mol/L NaOH
和 50ml 水中 , 再加 30g 酒石酸钾钠 , 用水稀释定容至 100ml( 保留期可是 7 天) 。

三、操作步骤
(1)标准曲线绘制：将葡萄糖此刻50-58 ℃条件下真空干燥至恒重，而后称取
500mg 溶于 100ml 苯甲酸溶液中（ 5mg 复原糖 /ml ） , 即成标准葡萄糖标液。

吸5mg/mL的
标准葡糖糖溶液 10m1于 100ml 容量瓶中 , 定容。

从中汲取 0、、、、、、2、3m1于 50m1
容量瓶 , 加 DNS试剂 3mL混匀 , 于开水浴中正确反响 5min( 从试管放入从头沸腾时算起 ), 拿
出立刻冷水浴中冷却至室温，定容。

即为浓度为 0ppm、2ppm、
4ppm、8ppm12ppm、15ppm、20ppm、30ppm的标准曲线。

以空白管调零在波长508nm 处比色 , 以 0D值为纵坐标 , 以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

(2)土壤蔗糖酶测定
称取土壤 , 置于 100mL容量瓶中 , 注入 30ml 8%蔗糖溶液 , 磷酸缓冲液和 1m1甲苯。

摇匀混淆物后 , 放入恒温箱 , 在 37℃下培育 24h。

到时拿出 , 快速过滤。

从中汲取
滤液 2-10ml（1ml）( 适当 , 无蔗糖比较汲取 20m1), 注入 50ml 容量瓶中 , 加 3m1DNS 试剂 , 并在沸腾的水浴锅中加热 5min, 随马上容量瓶移至自来水流下冷却 3min。

溶液因生成 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸而呈橙黄色 , 最后用蒸馏水稀释至 50m1,并在分光光度计上于 508mm处进行比色。

( 为了除去土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引
起的偏差 , 每一土样需做无基质比较 , 整个试验需做无土壤比较 : 假如样品吸光值超
标曲的最大值 , 则应当增添分取倍数或减少培育的土样。

)
（3）结果计算：蔗糖酶活性以 24h 后 1g 土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖（毫克） =a*4
a 代表从标准曲线查到的葡萄糖毫克数
4 代表换算成 1 克土的系数
过氧化氢酶活性测定——容量法
1.试剂配制
过氧化氢溶液 : 将 10m130%的过氧化氢用水稀释至1L, 此溶液不稳固 , 需暂时配置。

硫酸 : 浓硫酸溶于水 , 再用蒸馏水稀释至100ml
KMnO4溶液 : 称取化学纯高锰酸钾 , 溶于 1 升蒸馏水中 , 贮于棕色瓶中 , 备用。

如
果知道酶活性很高的话能够适合变化高锰酸钾浓度
2.操作步骤
(1)取 5g（2g）过 1mm风于土 , 置于 150mL（100ml）三角瓶中 , 并注入 10mL（40ml）蒸馏水和 % H2O2溶液。

(2)同时设置比较 , 即三角瓶中注入 10mL蒸馏水和 5mL %过氧化氢溶液 , 而不加土样，并作无士比较。

(3)将三角瓶放在振荡机振荡 (120r/min)30min 后, 加入 5mL L 硫酸 , 以稳固未分
解的过氧化氢 , 再将瓶中是悬液用慢速型滤纸过滤，汲取25mL滤液 , 用 L 高锰酸
钾滴定至淡粉色终点。

(30s 不褪色 )
3.结果计算
以单位土重耗费的L 高锰酸钾毫升数 ( 比较与试验测定的差 ) 表示土壤过氧化氢
酶活性 , 其计算式为 :
土壤过氧化氢酶活性 (ml KMn04/g 干土 )=(V0-V)/m 式中 ,
V0: 为滴定空白 (25ml 过氧化氢 ) 所耗费的高锰酸钾毫升数(m1)
V:为滴定试样所耗费的高锰酸钾毫升数 (ml)
m为烘干土壤重量 (g)
或许： 30min 后 1g 土壤过氧化氢酶活性=(V0-V)*T （ T 为高锰酸钾滴定度的校订当）
高锰酸钾溶液标定 : 汲取 2m1 草酸钠标准液（称取草酸钠溶于 1000ml 水即可。

）于200ml 三角瓶中 , 并加水至 80ml 左右 , 投入几粒玻璃珠 , 再加 5m11:3 的硫酸酸
化 , 在电炉上加热 2min, 取下稍冷 , 趁热 (70-80 度 ) 用高锰酸钾溶液滴定 , 滴为红色(30s 不褪色 ) 即达到终点 , 记下高锰酸钾的毫升数 (V) 。

高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算 c(1/5MnO4)=m/(V1-V2)*。