雷竹林存留有机覆盖物高效降解菌株分离及产酶条件优化
邻苯二甲酸二丁酯高效降解菌的分离、鉴定及降解特性
邻苯二甲酸二丁酯高效降解菌的分离、鉴定及降解特性杨统一;高俊贤;刘琦;连梓竹【摘要】从土壤中分离出1株能够以邻苯二甲酸二丁酯为碳源和能源生长的细菌XHYG.经形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列及系统发育分析,鉴定该菌株为无色杆菌(Achromobacter insolitus).对该菌株的降解条件进行优化,确定最佳降解条件为:温度30℃,pH =6.5 ～8.0.在最佳降解条件下,其在48 h内对400 mg/L DBP降解率达到90.67％,为邻苯二甲酸二丁酯的高效降解菌.底物降解广谱性试验表明,该菌株对邻苯二甲酸二辛脂(DOP)、邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)都具有良好的降解能力,表明具备良好的底物降解广谱性,说明该菌株在处理邻苯二甲酸酯类化合物的污染治理中有独特的应用潜力.【期刊名称】《江苏科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(029)006【总页数】5页(P607-611)【关键词】邻苯二甲酸二丁酯;降解特性;生物降解;降解条件;16S rDNA【作者】杨统一;高俊贤;刘琦;连梓竹【作者单位】江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018【正文语种】中文【中图分类】X172邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters，PAEs)是一类重要的有机化合物，被广泛用作塑料助剂、油漆溶剂、合成橡胶增塑剂及化妆品、香味品、润滑剂等生产原料中［1］.然而，由于邻苯二甲酸酯增塑剂并非与树脂共价连接，因此极易扩散到环境中.目前，PAEs在环境中已到了普遍检出程度，包括在陆地生态系统及水域生态系统等都能检测到PAEs的存在［2］.近期研究表明，PAEs具有致畸性、致突变性、致癌性及生殖毒性，可在极低浓度下干扰人和动物的内分泌系统，导致其发育紊乱［3］.且在环境研究领域，邻苯二甲酸酯类被中国环境监测总站、美国国家环保局(EPA)和欧盟列为优先控制污染物［4］.PAEs在自然界中的降解分为生物降解和非生物降解两种，而微生物降解是其降解的主要途径［5］.目前国内外有关PAEs微生物降解的研究有很多［6-7］，如Delfia sp.［8］，Sphingomonsa sp.［9］，Arthrobacter sp.［10］，Paenibacillus sp.［11］等.但已报道的菌株能降解DBP且能降解多种邻苯二甲酸酯类化合物的还较少，因此有必要筛选高效广谱的DBP降解菌，丰富降解菌种类.本研究从镇江市江苏科技大学西校区垃圾处理站土样中分离到了1株能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯的细菌，采用生理生化及16S rDNA序列分析等手段对该菌进行了鉴定，并研究其生长和降解特性，以期为PAEs污染物的治理及土壤修复提供一定的科学依据.1.1 实验材料实验土样取自镇江市江苏科技大学西校区垃圾处理站附近土壤.基础无机盐(MSM)培养基(g/L):K2HPO45.8，KH2PO44.5，(NH4)2SO42.0，MgCl20.16，CaCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.002 4，FeCl30.001 8，MnCl2·2H2O 0.001 5，pH=7.0，于121℃湿热灭菌20 min.固体培养基为含DBP的液体培养基加琼脂20 g/L.富集培养基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH=7.0，于121℃湿热灭菌20 min.主要试剂:邻苯二甲酸二丁酯(DBP，分析纯);邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP，分析纯);邻苯二甲酸二辛脂(DOP，分析纯);环己烷(色谱级)，甲醇(色谱级).1.2 实验方法1.2.1 DBP降解菌的筛选与纯化称取10 g土壤样品，加入20 ml无菌水，剧烈振荡混合均匀后于4 000 r/min离心机中离心5 min，取上清液;接着重复此步骤2次，最后取上清液获得土壤溶液.取分别稀释100倍、1 000倍、10 000倍的土壤溶液，涂布在固体MSM培养基(含DBP 100 mg/L)于30℃培养箱内培养7 d.然后挑取筛选的菌落接种于含DBP 200 mg/L的液体MSM培养基，150 r/min、30℃ 的摇床培养7 d，再用划线法划线于固体MSM培养基(含DBP 200 mg/L)于30℃培养箱内培养7 d，进一步分离单菌落.重复上述两步并逐步提高培养基中DBP含量依次为200，250，300，350，400 mg/L.最后将分离出的单菌用富集培养基富集.1.2.2 菌株的生理生化鉴定降解菌株形态及生理生化特性鉴定参照常见细菌系统鉴定手册［12］等文献.1.2.3 菌株DNA的鉴定降解菌株分子生物学鉴定采用16S rDNA序列分析.首先提取分离的降解菌DNA作为模板，利用16S rDNA基因通用引物F27和R1492进行PCR扩增.其中，引物F27为5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，引物R1492为5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’.PCR扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性40 s;55℃退火40 s;72℃延伸90 s，30个循环; 72℃最终延伸7 min，4℃保存.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序工作.将测序结果提交GenBank，获得序列号KM598778，并同GenBank数据库中的基因序列进行BLAST比对，以获得相似性较高的相关菌株，采用MEGA6.0软件进行多序列比对，并构建系统进化树.1.2.4 溶液中PAEs的含量测定采用高效液相色谱法检测溶液中PAEs，具体处理方法如下:待测溶液于超声波振荡器中振荡10 min后取10 ml加入20 ml环己烷，剧烈振荡后放入超声波振荡器中振荡5 min，后倒入离心管在高速离心机(5 000 r/min)中离心分离取上层有机相，再用孔径为0.22 μm的有机相过滤器过滤后上机测定.高效液相色谱条件:色谱柱为5μm Eclipse XDB-C18柱;流动相为甲醇∶水=90∶10;检测器波长为228 nm;柱温为35℃;柱压为15 bar;流速0.5 mL/min;进样量为10 μL;保留时间为11 min.1.2.5 生物量测定方法测定菌株的生物量，采用721型可见分光光度计在600 nm处测量培养基的光密度OD600.1.3 降解菌底物广谱性测试在基础无机盐培养基中分别加入邻苯二甲酸二辛脂(400 mg/L);邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(400 mg/L)于121℃湿热灭菌20 min.以2%的接种量将降解菌种子液接种到100 mLMSM中，160 r/min、30℃摇床培养.培养5 d后取样，用高效液相色谱法测定不同邻苯二甲酸酯的残留量.1.4 菌株的降解特性研究1.4.1 降解菌对DBP的降解曲线及生长曲线将菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后将上述菌液1 ml接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L) 25 ml中，在150 r/min、30℃ 的摇床培养，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.每24 h定时取样用高效液相色谱法测定其中DBP的含量，并测定其OD600值.1.4.2 DBP高效降解菌的降解条件优化1)温度将菌株的菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分别接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)25 ml中，在150 r/min、温度分别为25，30，35，40，45℃ 的摇床培养5 d，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.用高效液相色谱法测定其中DBP的含量.2)pH将菌株的菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分别接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)25 ml中，将5份培养基pH分别调整为6.0，7.0，8.0，9.0，10.0在150 r/min、30℃ 的摇床培养5 d，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.用高效液相色谱法测定其中DBP的含量. 2.1 菌株XHYG的分离及部分生理生化特征经过富集培养，分离得到1株能够在DBP含量为400 mg/L的MSM培养基中很好生长的降解菌，此菌株能以DBP为唯一碳源很好地生长，将其命名为XHYG.XHYG菌株在MSM平板上于30℃恒温培养箱中培养5 d后，菌落呈圆形，不透明，黄色，中央部分突起，边缘部分光滑，质地致密且有光泽，不含水溶性色素，在显微镜下观察为球状.生理生化测试发现，菌株XHYG为革兰氏阴性菌，接触酶呈阳性反应，淀粉水解酶呈阴性反应，不产硫化氢气体，明胶液化反应、甲基红反应均呈阴性反应，能够发酵葡萄糖(详见表1).2.2 降解菌底物广谱性测试接种5 d后观察菌株XHYG都能很好地利用DOP和DEHP，根据图1所示，菌株XHYG对DOP的降解较DEHP要好.这与文献［13］中邻苯二甲酸脂类的生物降解效果与碳链长度和复杂程度呈反比相一致.2.3 菌株XHYG的16S rDNA分子鉴定与系统发育分析测序结果提交 GenBank的登录号为KM598778.在GenBank中进行BLAST比对分析，结果发现与菌株XHYG的16S rDNA序列相似性最高的是Achromobacter insolitus，其相似性达到99%.结合其形态学和生理生化特征，可以初步确定XHYG为无色杆菌(Achromobacter insolitus).选取部分文献报道的PAEs降解菌，用MEGA 6.0软件包构建系统发育树(图2)，对比降解菌的系统进化关系.由图2可以看出，文中筛选的XHYG菌株与无色杆菌(Achromobacter insolitus)处于同一分支，具有相同的进化距离，因而更进一步说明菌株XHYG为无色杆菌属.从图2还可看出，部分PAEs降解菌与XHYG菌株进化距离较远，说明PAEs降解基因广泛分布在不同种属.2.4 菌株XHYG的生长曲线和降解曲线菌株XHYG的生长和降解曲线如图3.由图3可以看出，在0～1 d时，菌株XHYG生长缓慢，DBP的降解率较低，培养基呈现淡淡的乳白色;菌株在1～3 d为迟滞期;3～5 d为对数生长期;5 d后进入平衡期;从降解曲线上来看，菌株在48 h时对400 mg/L DBP降解率达到90.67%，在3～6 d，菌株XHYG以DBP为唯一碳源和能源迅速繁殖生长，在培养基底部逐渐产生灰白色悬浮颗粒物即菌体，而DBP也被大量降解，培养基颜色逐渐澄清;在5～6 d时期，菌株的生长进入平衡期，其OD600稳定在1.2左右，菌株的生长量逐渐达到最大值，DBP的残留量仅为4.09 mg/L，降解率达到98.99%.因此，确认菌株XHYG为DBP的高效降解菌.2.5 温度对菌株XHYG降解DBP的影响由图4看出，菌株XHYG对DBP的降解效果先随温度的升高而升高，达到最大值后，随着温度的升高而降低，菌株XHYG的最适生长温度为30℃，在温度超过35℃后降解活性大大降低.由此表明，温度过高或过低都会使菌株XHYG的生长受到抑制，降解活性降低.这与文献［11］的研究结果一致.这可能由于当温度过低时，菌体内酶的活性在低温下大大降低，导致菌株对DBP的降解效率降低;当温度过高时酶活性失活导致降解效率降低.2.6 pH对菌株XHYG降解DBP的影响由图5可以看出菌株XHYG的最适生长pH值在6.5～8.0左右，菌株的降解率能达到85%以上，而当pH值过低或者过高时菌株的生长均受到抑制，降解活性降低.由此表明，中性环境更利于这株菌株对DBP的降解.这与文献［16］分离出的HS-B1菌株相似，该菌株被鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，当pH＞8.0，菌株的降解效率大大降低.1)从土壤中分离得到了一株能够以DBP为碳源和能源生长的细菌XHYG，经过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列系统学分析，初步鉴定该菌株为无色杆菌(Achromobacter insolitus).2)XHYG生长和降解DBP的最佳培养条件为:温度30℃，pH 7.0;在此条件下，菌株迅速利用DBP作为碳源和能源进行生长，能够在DBP浓度为400 mg·L-1的无机盐培养基中生长良好，有较高的耐受性和降解效率.【相关文献】［1］Blount B C，Milgram K E，Silva M J，et al.Quantitative detection of eight phthalate metabolites in human urine usingHPLC-APCI-MS/MS［J］.Analytical Chemistry，2000，72(17):4127-4134.［2］Zolfaghari M，Drogui P，Seyhi B，et al.Occurrence，fate and effects of Di(2-ethylhexyl)phthalate in wastewater treatment plants:a review［J］.Environmental Pollution，2014，194:281-293.［3］Gu J D，Li J，Wang Y.Biochemical pathway and degradation of phthalate esterisomers by bacteria［J］.Water Science Technology，2005，52(8):241-248.［4］骆祝华，黄翔玲，叶德赞.环境内分泌干扰物:邻苯二甲酸酯的生物降解研究进展［J］.应用与环境生物学报，2008，14(6):890-897.Luo Zhuhua，Huang 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一株高效羽毛降解菌株的分离与鉴定
１４ 样品采 集 ．
样 品采 集 于长期堆 放死鸡 的发 酵池 ， 取样 品１０ ． ｇ 加 １ Ｌ的无 菌生理 盐水混 匀 ， 置 １ ｉ ， ， ０ｍ 静 ０ｒ ｎ 取上 ａ
有高效 降解羽 毛角 蛋 白的细 菌 ， 蛋 白饲 料 生 产 中 在
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关键 词 ： 羽毛 ； 角蛋 白； 分离 ； 鉴定 ； 降解
中图 分 类 号 ：５ Ｑ 文 献标 识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ６— ３ ６ ２ １ ）１— ０ ８— ３ １０ ８ ７ （０ ０ ０ ０ １ ０
产业 界在废 弃 物处 理 阶段 ， 产 生 很 多 环境 问 会
１ 材料 与方 法 １ １ 材料 ．
题， 而资源 短缺又 是 人类 面 临 的一个 急 需 解决 的问 题 。在这种 背景 下 ， 世界 各 国对各 种 废 弃 物 的再 生 资源 化 ， 物可 降解性 高分子 制品 的开发 ， 生 天然 高分
子用 于各种 功能 性制 品的研 究 正 在 积极 地 进行 ¨ 。
氨基酸和生物 资源
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Ａ ｎ ｃｄ ｍｉ ｏ Ａ ｉ ｓ＆ Ｂ ｏ ｉ ｓ ｕ ｃ ￥ ｉ ｔ Ｒｅ解菌株 的分离与鉴定
聂康康 ， 大伟 ， 姚 郭俊清 ， 王 政， 杨德吉
（ 京农业 大学 动物 医学 院 江苏 南京 ２ ０ ９ ） 南 １ ０ ５
具 有潜 在的广泛 的应 用前 景 。
清液备 用 。
１５ 羽毛 降解 茵的分 离、 ． 纯化 及 降解效果 测定
１５ １ 殖 培养 取样 品上 清液 １ｍＬ接 种 营养 肉汤 ．． 增 培 养基 ，７ ，８ ｍｉ一， 养 ２ 。 ３ ℃ １０ｒ・ ｎ 培 ４ｈ
有机材料林地覆盖对雷竹林生态系统的负面影响研究综述
竹林生物量产出和土壤酸化使土壤有效氮、速效 磷、速效钾显著降低（陈双林等，２００２，２００５），而林地 覆盖物的分解又显著增加土壤速效钾、速效磷含量， 抵消了降低量，增幅仍分别达４５．１％、１５９．２％（姜培 坤等，１９９９）。且竹林大量施用氮肥，使氮输入量超过 系统的需要，土壤阳离子损失量增加，造成除氮素外 的必需养分元素亏缺，出现“氮饱和”效应（陈双林等， ２００２，２００５），从而造成土壤Ｎ、Ｐ、Ｋ比例严重失衡，尤 其是难移动性土壤磷素的高存留（姜培坤等，２０００）。 １．４毒害化学物积累 覆盖竹林土壤酸化使土壤中Ａｌ、Ｍｎ、Ｐｂ、ｃｒ、Ｚｎ 等重金属元素从固定态转化为植物有效态，含量明显 高于未覆盖竹林（姜培坤等，２００５；杨芳等，２００３）。林 地存留覆盖物分解产生大量对竹子鞭根系生长有抑 制性化感作用的酚酸类物质，其含量随覆盖年限增加 而上升，多酚氧化酶活性则呈相反的规律，从而使酚 酸在土壤中不断积累（郑仁红，２００６）。覆盖竹林竹笋 中硝酸盐含量明显高于未覆盖竹林，最大值１
Ａｂｓｔ憎ｃｔ：Ｔｈｅ ｍｕｌｃｈｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗｉｔｈ ｏｒｇａｎｊｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｐ．ｐｒｎｅ∞ｚ ｆｏｒｅｓｔ、忸ｓ ｃｏｎｏｍｉｃ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｂａｍｂ００，ｓｏｍｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ａｐｐｅａｒｅｄ
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低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化
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中图分类号 ：￥ ７ ８ ９ ；￥ １ ８ ２ 文献标 志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ５ — ９ ３ ６ ９ （ ２ ０ １ ５ ） １ ０ — ０ ０ ７ ４ — ０ ８
李春艳， 于琦， 冯露 ． 等． 低温纤维素降解菌分离鉴定及产 酶条件优化［ Ｊ 】 ． 东北农业大学学报． ２ ０ １ ５ ， ４ ６ （ １ ０ ） ： ７ ４ － ８ １ ．
Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 产羧 甲基纤维素（ Ｃ ａ ｒ ｂ ｏ ｘ ｙ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｃ ｅ Ｕ ｕ ｌ ｏ ｓ ｅ ，Ｃ ＭＣ ） 酶活特性影响情 况。结果表明，菌株 Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 最佳产酶条件 为培
养时间７ ４ ． １ ｈ ，温度 １ ０ ． ５ ℃，ｐ Ｈ７ ． １ ，接种量 ２ ． １ ％。在最佳条件 下，菌株 Ｆ Ｌ Ｘ 一 １ 产Ｃ Ｍ Ｃ酶活值为 １ ４ ． １ ２Ｕ ・ ｍ Ｌ 『 。 关键词 ：纤维素 ；低 温降解 茵；Ａ ｒ ｔ ｈ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｓ ｐ ． ；Ｃ Ｍ Ｃ酶 ；响应面分析 法
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
霞品研究与开发
Ｆｏ ｄＲｅｅ ｒ ｈ Ａｎ ｖ ｐ ｎｔ ｏ ｓａ ｃ ｄＤｅ ｄｏ ｍｅ
２１ ０ １年 ６月
第３ 卷 期 １ ２ 第６ １ ９
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
李 鑫玲 ’孙晓菲 ’孟楠 ’ 卜 ， ， ， 美玲 ’刘进 。
（． １河南科 技大学 食 品与生物 工程学 院 ， 河南 洛阳 ４ １０ ； ． 岛啤酒 （ ７０３ ２青 太原 ） 有限公司 ， 山西 太原 ０ ０ ３ ） ３０ ２
４ 结 语
Ｃ ｏｅｅ ［ ． ｕｒｉｎＲ ｓａｃ ， ０ ，６ ５ ６ ５ ０ ｒ ａ ｔｎｓＪ Ｎ ｔ ｔ ｅｅｒｈ ０ ６２ ： ５ — ６ １ ｉｏ ２ 【】 Ｊｎ ａ Ｍ． ｏｄ ＇－ ｕｉ＇ ｅ ｎ ｒ ｏｏｅ ｕ ｕ ｅＣ ｓ ｏ ３ ａｎｔ Ｒ ｌａ Ｇ ｔ ｒ ｚａｄＭａ ａＤ ｌｒｓＬ ｑ ｅｄ ａｔ ． ｎ ｅｒ ｉ ｒ
摘 要 ： 土壤样本 中分 离出一株具有较 高活力 的产脂肪酶 菌株 ， 步确定为假 单胞菌属。对该 脂肪 酶产 酶条件进 从 初
行 优 化 ， 佳 碳 源为 糊精 、 最 氮源 为 硫 酸铵 ， 适发 酵 温度 为 ３ ， 最 ０℃ 最适 起 始 ｐ 为 ７ 。 Ｈ ． ０
关键词 ： 脂肪酶 ； 假单胞菌属 ； 产酶条件
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速搅 拌均匀 ， 高压灭菌倒板前再用磁力搅拌器混匀 ； 种
子培养 基 （ ： 萄糖 ２ ，Ｎ ２ ．， Ｐ ４ ．， ％）葡 ． （ Ｈ ） ０ ０ ＫＨ Ｏ ０１ ０ ｓ ５ 橄榄油 １ ， Ｓ ７ ． ， 白胨 ２５ ｐ ．； 酵 ． ＭｇＯ ・Ｈ ００ ５ 蛋 ０ ０ ．，Ｈ ７ 发 Ｏ 培养基（ ： 白胨 ２ ， ％）蛋 ． 蔗糖 ０ ， ０ ． 橄榄油 １ ，Ｎ ４￣ ４ ５ ． （ Ｈ ） Ｏ ０ Ｓ
产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化
分析 ， 确定该菌株为黑 曲霉 （ ｓ ｒｉｕ ｒ． Ａｐ ｇｌｓ ｅ ｌ ｎ ）对该菌株的产酶条件进行优化 ， 发现该菌株在 以体积分数为 Ｉ 的橄 ％ 榄油为诱导物 ， ｇ Ｌ蔗糖为碳源 ， ／ ５／ ４ ｇ Ｌ蛋 白胨 为有 机氮源 ， ｇＬ（ Ｈ ） ｓ 为无机氮 源 ，Ｈ为 ６ ５的培养基 ０ １ ／ Ｎ ０ ｐ ． 中， ２ ｃ，８ ｒｎ摇床培养 ４ ， 于 ８ ｏ １０ｒａ ／ｉ ８ｈ 可达最 大酶产量（ ７６± ． ）ｍ ｏ ・ ａ ～ ・ 一． ３ ． Ｏ ８ ｍ ｌ ｒｎ ｉ Ｌ 关键词 脂肪酶 ； 黑曲霉 ； 筛选 ； 产酶条件
Ｇ Ｃ Ｇ一 ，８ ５一 Ｆ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｆ Ａ － ） Ｃ Ａ ３ １ Ｒ： Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ Ｆ Ｔ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ ３ 进行 Ｐ Ｒ扩增 ． Ｃ
１５３ Ｐ Ｒ扩增产物的纯化与测序 扩增的 Ｐ Ｒ产物用 Ｏ ｅａ ．． Ｃ Ｃ ｍ ｇ 生产的凝胶 回收试剂盒纯化 ， 操作均按说 明书进行 ．纯化 产物 交 由上海桑 尼 生物工程 有 限公 司 测序 ． １ ５ ４ 序 列分析及 系统发 育分 析 将得 到 的 １ Ｓｒ Ｎ ．． ８ Ｄ Ａ测 序 结果 提交 到 Ｎ Ｂ 数据 库并 进 行 Ｂ Ａ Ｔ比对 ， ＣＩ ＬＳ 找 到并下 载典 型 的菌株 序列 与实验 菌株 的序列 用 Ｃｕｔ ． ｌｓ ｌ ２ ０软件 进行 同源性 分 析 ， 用 ＭＥ Ａ３ １软件 ａＸ 并 Ｇ ． 构建 系统 发育 树 ． １６ 产酶 条 件优化 ． １６ １ 温 度对 产酶 的影 响 不 同的温度条 件下 ， 曲霉 的生 长状 况有差 别 ， ．． 黑 产脂 肪酶 的能 力也 有差 异 ． 了 为 使其 在较 好 的生长 条件 下能 达到最 佳 的产酶条 件 ， 将筛选 得 到 的菌株 以发酵 产酶 培养基 为基 础 ， 于不 同 特 置 的温 度下 （ ６２ ，０３ ，４℃ ） 养 ， ２ ，８３ ，２ ３ 培 以检测 其最佳 产酶 温度 ． １６ ２ 初 始 ｐ ．． Ｈ对 产酶 的影 响 由于 ｐ Ｈ值对 黑 曲霉本 身 生长 和产 脂肪 酶 能 力 的影 响较 大 ， 使 Ｈ －３菌 为 Ｂ０ 株达 到最佳 的产 酶条 件 ， 特设定 不 同的 ｐ Ｈ梯 度 （ ． 、． 、 ． 、 ． 、 ． 、 ． 、 ． 、 ． 、０ ０ 以得 到该 菌株 ６０６ ５ ７０ ７ ５ ８０ ８ ５ ９０ ９ ５ １． ） 产酶 的最佳 ｐ Ｈ值 ． ’ １６ ３ 不 同诱导物对产酶的影响 研究表明不同的诱导物对菌株产脂肪酶 的能力有很大的影响 ， ．． 因此 ， 设 定不同的诱导物验其对菌株产酶能力 的影响． １６４ 不 同碳源对产酶的影响 ．． 黑曲霉可以利用不同的碳源生长产酶 ， 但是碳源不同， 会有不 同的产酶能
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
生物化工 Biological Chemical Engineering
文章编号：2096-0387（2019）06-0036-04
Vol.5 No.6 Dec. 2019
环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
刘静，刘张虎，张雨霏
（湖北大学知行学院，湖北武汉 430011）
1 实验材料
1.1 土壤样本及菌种 本实验所使用土壤样本采集自湖北大学知行学
作者简介：刘静（1980—），女，湖北鄂州人，硕士，讲师，研究方向：生物工程教育研究。
第2期
刘静等：环境中产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的优化
·37·
院周边，取样地主要为食堂排水渠污泥、餐馆垃圾处 2 实验方法
理处和学生公寓垃圾堆放处附近土壤。
司；胰蛋白胨（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限
将初筛所得菌株点样接种于酪素平板上，于 37℃
公司；酵母提取物 ( 分析纯 )：OXOID；葡萄糖、乳糖、 恒温培养箱中培养 24h 后挑选出 5 个透明圈与菌落
蔗糖（均为分析纯）：上海展云化工有限公司；果糖（生 直径比比值较大的菌株，接种于 50 mLLB 液体培养基
2.1 菌株富集与初筛
土壤样品中筛选得到并优化培养的菌株为一株
每 份 土 壤 样 品 加 入 无 菌 水 稀 释，取 稀 释 液 各
短杆细菌。 1.2 试剂
0.1 mL 均匀涂布于 LB 平板中，置于 37℃恒温培养箱 中培养 24 ～ 36h 后观察菌落生长状况，并挑选出清
干酪素、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试 晰的单菌落在斜面培养基进行划线培养。将分离出
应用于环保行业中 [3]。 土壤中的微生物种类繁多，易于从中筛选出产蛋
土壤中木质素降解菌株的筛选及产酶条件优化
王进军，韦慧仙，鲍 飞，等．土壤中木质素降解菌株的筛选及产酶条件优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（１６）：２１０－２２２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．１６．０２９土壤中木质素降解菌株的筛选及产酶条件优化王进军，韦慧仙，鲍 飞，于 昊（扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州２２５１２７） 摘要：筛选能高效降解农业废弃物中的主要成分———木质素的菌剂，探究其产酶特性并优化产酶条件。
采用涂布平板法分离纯化得到６８株菌种，采用ＰＤＡ－愈创木酚培养基显色试验、ＰＤＡ－苯胺蓝脱色试验、ＰＤＡ－氯化锰显色试验进行初筛，测定Ｌａｃ、Ｌｉｐ、Ｍｎｐ活性复筛。
通过内转录间隔区（ＩＴＳ）测序法鉴定目标菌株。
基于单因素试验和响应面法对菌株产酶能力（培养时间、温度、溶解氧及培养基条件等）进行研究和优化。
结果表明，分离的６８株菌种经筛选ＭＪ１菌株为目标菌株，分子生态学鉴定其为蓝状菌属真菌Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｓｉａｍｅｎｓｉｓ。
单因素试验得出菌株的最佳产Ｌａｃ、Ｍｎｐ时间为６ｄ，产Ｌｉｐ时间为１０ｄ，最佳产酶培养温度为３０℃，摇床转速为１２０ｒ／ｍｉｎ，接菌量为２％，ｐＨ值为５。
响应面优化后确定最佳产酶条件为培养温度３０．１１℃，接菌量１．６６％，ｐＨ值５．２２，此最优条件下Ｌａｃ、Ｌｉｐ、Ｍｎｐ３种酶的活性分别为１１０．４１、１１８．３３、２１８．４Ｕ。
提示菌株ＭＪ１在优化后的产酶条件下制得的菌剂能够促进农业废弃物的高效降解，为生物法大规模降解木质素提供参考，也为后续其他相关研究奠定基础。
关键词：木质素；产酶条件；酶活；响应面优化；单因素试验 中图分类号：Ｓ１８２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）１６－０２１０－１２收稿日期：２０２２－１０－２７基金项目：国家自然基金面上项目（编号：８１８７３８７７）；教育部留学回国人员科研启动基金（编号：２０１５１０９８）；扬州大学高层次人才科研启动基金；扬州大学“青蓝工程”项目。
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。
方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。
2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。
2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。
2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。
3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。
2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。
5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。
2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。
发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。
2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。
3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。
4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。
5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。
结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。
2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。
3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。
4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。
高效木质素降解菌株的分离筛选
பைடு நூலகம்
２ 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 博 士 后科 研 工 作 站 ， 龙 江 哈 尔 滨 １０ ８ ． 黑 ５０ ６ ３ 哈 尔 滨 理 工 大 学 化 学 与环 境 工程 学 院 ， ． 黑龙 江 哈 尔 滨 １０ ４ ） ５０ ０
摘 要 ：为 筛 选 能 高 效 降 解 木 质 素 的 菌株 ， ３ 从 １份 采 集 的 朽 木 和 土 壤 样 品 中分 离纯 化 获 得 １ ５株 茵 ； ５
质 素 过 氧 化 物 酶 、 过 氧 化 物 酶 和 漆 酶 的 活 力 分 别 为 ０ ０ ７ ０ ０ ０ ０ １ ４和 ０ ０ ０ ００ ９ ００ ０ 锰 ． ８ 、 ． ６ 、 ．４ ． ７ 、 ． ５ 、 ． ０
Ｕ ． Ｌ ． ｍ
关 键 词 ：木 质 素 ； 质 素酶 ； 质 素 降 解 菌 ； 离 筛选 木 木 分
基 于此 ， 文 从 黑龙 江 省 丰 富 的 自然朽 木 及 土 本 壤样 品中分离 、 纯化 相关 菌株 ， 并分 别通 过初 筛
１ ２ １ 菌株 分 离纯化 ．．
分别 称取 ５ｇ样 品
捣碎 后 ， 加入 到 装 有 ５ ． 生 理盐 水 和 ０ ｍＬ ０ ９
少 量玻 璃 珠 并 经高 压 灭 菌后 的三 角瓶 中， 荡 振
Ｄ Ｉ１ ．７ ５ｊｉ ｎ １ ０—２ ９ ２ １ ．３ ０４ Ｏ ： ０ ３ ８ ／ ． ｓ ． ０ ８ ９ ０ ．０ １ ０ ． ０ ｓ
一种果胶酶生产菌株的分离及其产酶条件优化
株， 并将 分离得到的菌株在摇瓶发酵 培养 、 测定其酶活力 ， 其发酵 培养基 的初始 ｐ 最适 温度 、 Ｈ、 最适接 种量及
发酵周期进行初步研究． 结果表 明 ： 经过筛选得到 的产果胶 酶菌株在发 酵培养基 的初 始 ｐ Ｈ为 ７ ０ 培养 温度 ．、
为３ ３℃ 、 接种量为 ３ ％ 、 ０ 发酵周期为 ５ ６ｈ时， 此菌株产酶的酶活力最 高 ， 化后 的条件 大大提高 了菌株的产 优
蛋 白胨 质 量 分 数 １ ， 化 钠 质 量 分 数 ０ ５ ； ％ 氯 ． ％ 发 酵 培养基 ： 胶质 量 分 数 ０ ５ ， 白胨 质 量 分数 果 ．％ 蛋
１ ， 化钠 质量分 数 ０ ５ ％ 氯 ． ％．
１２ 方法 ．
尽管 自然 界 中天 然果 胶 酶 广泛 存 在 于 动植 物
第３ ４卷第 ４期
２１年 ０ ０２ ４月
武
汉
工
程
大
学
学
报
Ｖｏ． ４ Ｎｏ ４ １３ ． Ａｐ ． ２ １ ｒ ０２
Ｊ Ｗ ｕ ａ Ｉｓ． Ｔ ｅ ． ． ｈ ｎ ｎｔ ｅ ｈ
文章 编 号 ：６４— ８ ９ ２ １ ）４— ０ ５ ４ １７ ２ ６ （ ０２ ０ ０ １ —０
污 水处 理池采 集 土样． １ １２ 试 剂与 仪 器 ．．
产 ）Ｄ Ｓｐ 计 ， ， Ｎ ，Ｈ 电子天 平 ，０ １型振 荡愠 温 培 养 ２０
收 稿 日期 ：０２— ３—１ ２１ ０ ５
１２ １ 筛选路 线 ．． 菌 种保 存 ． １２２ 筛选方 法 ．．
采 样 土样 一 富集 培养 一 初
筛 培养 一复 筛培 养一 种 子罐 培 养一 发 酵罐 培 养一 ａ ．富集 培养 ： 将采 集 到 的土
可降解PLA
ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗｅｉｇｈｔｌｅｓｓｎｅｓｓ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｔｃｈｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅ⁃
添加土壤稀释液的 ＰＬＡ ／ ＰＢＡＴ 塑料膜－无机盐液体培养基
作为空白对照组。
第一个降解周期培养结束后，继续富集转接时，将 １０％
聚类后，将微生物在门、纲、目、科、属、种分类水平上进行群
分析，计算细菌群落的 α－多样性指数，包括 Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ＯＵＴ 和
Ｓｈａｎｎｏｎ 指数等，并基于加权和非加权分析不同批次细菌群
安徽农业科学，Ｊ．Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ． ２０２４，５２（４） ：５７－６１，７０
可降解 ＰＬＡ ／ ＰＢＡＴ 塑料的微生物菌群结构研究
裴雯玉１ ，江雨韩１ ，李 娜１ ，陈 怡１ ，吴 弘１，２∗
（１．天津师范大学生命科学学院，天津 ３００３８７；２．天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 ３００３８７）
回收后在 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ 测序平台上完成高通量测序分
１．３ 降解菌群的筛选和转接富集 首先将 ＰＬＡ ／ ＰＢＡＴ 复合
中浸泡过夜，随后在 ７５％酒精中浸泡 ４ ｈ，用无菌水冲洗干净
备用。 称取 １０ ｇ 土样于 ９０ ｍＬ 无菌水中，制得土壤稀释液。
木质素降解菌的筛选和产酶特性初探
木质素降解菌的筛选和产酶特性初探姜立春;刘羽;林寿露;赵丽萍;阮期平【摘要】为了促进生物高效降解木质素,采用苯胺蓝、氯化锰、α-萘酚平板法和木质素降解试验,从腐竹中分离、筛选获得1株具有高效降解木质素活性菌株,命名为LQ-04.对该菌株产酶条件进行了优化,其优化工艺为:碳源为葡萄糖10 g/L,氮源为酵母膏10 g/L,pH为6.0,温度为40℃,转速为180 r/min,在该优化条件下木质素过氧化物酶(LiP)活性高达82.8 U/mL.这将为木质素的生物降解提供实验依据.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2016(035)008【总页数】6页(P6-10,15)【关键词】腐竹;木质素;过氧化物酶;酶学特性;降解率【作者】姜立春;刘羽;林寿露;赵丽萍;阮期平【作者单位】绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000【正文语种】中文【中图分类】Q939.9木质素(lignin)是自然界植物组织的有效成分之一，仅次于纤维素的第二大有机化合物，其同纤维素和半纤维素是构成植物细胞壁的重要成分[1].它的主要作用是增加植物组织的强度和硬度，起着粘合植物纤维和使纤维刚挺的功能[2].木质素的分子结构比较复杂，主要由苯丙烷类结构单元通过碳键与醚键等多种形式的共价链连接形成，是一种非水溶性的、没有规则的、三维空间网状的芳香族高聚化合物[3].由于木质素微观结构的复杂性与含有较稳定的键型结构，致使其不容易被降解[4]. 目前研究和应用较广的降解木质素菌种大多是真菌门担子菌纲的白腐菌[5]，但实际上，对木质素的降解是依靠真菌、细菌、放线菌和相应的微生物共同起作用而完成的.细菌在木质素降解的过程中主要起着间接的作用，可在一定程度上改变木质素结构，其降解木质素的机理随细菌菌种不同而不同[3].放线菌在木质素降解的研究中，其研究范围比较狭窄，但在降解木质素的过程中也有着不可忽视的作用[6].木质素降解酶系比较复杂，最为重要的三种酶是木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)[7].除此之外，还有一些其他酶类也对木质素的降解有一定的影响.虽然木质素降解酶种类繁多，但并不是每一种菌都能产生上述酶类，因而不同种类的微生物其降解机制不同.同时，诸多因素影响木质素降解酶的活性，主要有碳源、氮源、初始pH、培养温度、诱导剂、碳氮比例与表面活性剂等[8-10].张安龙等[11]以树枝和树皮为样本筛选得到一株产漆酶能力强的木质素降解菌，通过产酶条件优化发现加入诱导剂CuSO4浓度为0.5 mmol/L最有利于该菌株产漆酶.董旭杰等[12]通过对3种白腐菌产木质素降解酶活研究认为，培养基中的碳氮比对锰过氧化物酶与漆酶产生存在一定的影响.漆酶易在高碳低氮的培养条件产生，而锰过氧化物酶在低碳高氮的培养下易产生.乔乔等[13]通过添加不同的氮源来研究黄曲霉对木质素降解酶的效果，发现无机氮源组优于有机氮源组.王仁祐等[14]研究结果显示生物表面活性对木质素降解菌产酶存在一定影响，能够提高黄孢原毛平革菌的锰过氧化物酶活性，也能将简青霉产酶高峰期提前.因此，研究菌株发酵产酶条件优化，对提高菌株对于木质素的降解能力具有重要的科学意义.本文通过以采集的腐竹作为研究材料，结合苯胺蓝、氯化锰和α-萘酚平板的变色反应分离和筛选能高效降解木质素优良菌株.之后对获得的菌株优化发酵产酶条件和酶学特性进行了初步研究，进而获得该菌株最适产酶的优化条件.这将为采用微生物降解木质素提供实验依据.1.1 供试菌株试验所用多年堆积的朽竹和腐土样本采自四川永盛竹纤维有限公司.1.2 培养基初筛培养基：K2HPO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.2 g，CaCl2 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，微量MnSO4·H2O，竹粉10 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水定溶至1 L.苯胺兰培养基：马铃薯200 g，酵母粉15 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，氯化钠5 g，苯胺兰0.1 g，pH=7.0，琼脂粉20 g，加蒸馏水定溶至1 L.氯化锰筛选平板：MnCl2·4H2O 0.15 g，琼脂20 g，自来水定容1 L.α-萘酚筛选平板：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g,MgSO4·7H2O 1.5 g，VB 0.1 g，琼脂20 g，自来水1 L，待冷却至50 ℃，添加单独灭菌的0.005 % α-萘酚[15].1.3 试验方法1.3.1 菌株筛选将腐竹样本1 g于100 mL生理盐水中震荡1 h，梯度稀释10-1-10-6并涂布于初筛培养基上，每个平板涂布100 uL，28 ℃培养7 d.逐次分离直到获得单菌落，均同时接种在苯胺蓝、α-萘酚与氯化锰3种鉴定培养基平板上，在28 ℃条件下培养4-5 d.通过菌苔周边培养基颜色变化初步判定各个菌株产酶能力，方法见文献[8].1.3.2 酶活的测定(1)粗酶液的制备将初筛到的菌株接种于液体产酶培养基中，32 ℃，150 r/min培养48 h，5 000 r/min离心8 min，得到上清液为粗酶液.(2)木质素过氧化物酶125 mmol/L的酒石酸钠缓冲液(pH3.0)3.2 mL，10 mmol/L藜芦醇100 uL，粗酶液0.6 mL，放至32 ℃水浴锅预热，加入H2O2溶液(10 mmol/L)100 uL开始反应，3 min后在310 nm处测定OD值变化情况.酶活力定义(U/mL)：每分钟每毫升培养基滤液增加0.1个OD值为一个酶活力单位[16].(3)锰过氧化物酶乳酸钠缓冲液(50 mmol/L pH4.5)3.4 mL，MnSO4溶液(1.6 mmol/L)100 uL，0.4 mL的粗酶液，放至32 ℃水浴锅预热，加入H2O2溶液(1.6 mmol/L)100 uL开始反应，3 min后在240 nm处测定OD值变化情况.酶活力定义(U/mL)：每分钟每毫升培养基滤液增加0.1个OD值来表示[17].(4)漆酶50 mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)1.5 mL，10 mmol/L的愈创木酚1 mL和1 mL粗酶液，放在25 mL试管中振荡混匀，32 ℃反应10 min，测定470 nm下OD值变化.酶活力定义为：1 min内吸光度增加0.01所需要的酶量为一个酶活力单位[18].每个因子都做3个平行实验.1.4 木质素降解率测定将LQ-04在合适条件下接入上述培养基中，分别在第0、2、4、6、8、10 d后用无菌吸管吸取2 mL培养液，用粗滤纸过滤后，于5 000 r/min离心8 min，取上清液经适当稀释后，于280 nm下比色，测定木质素磺酸钙含量[19].配制木质素磺酸钙标准溶液，测定不同浓度下的吸光度，绘制标准曲线.木质素磺酸钙含量与吸光值间的线性回归方程为y=0.086 9x+0.202 8，相关系数R2=0.997 5.木质素磺酸钙降解率(%)=(初始含量m1-发酵后含量m2)/初始含量m1×100%.2.1 菌株分离与筛选将分离得到的10个菌株分别接种在3种不同的选择固体培养基上，经过4-5 d培养观察其结果，显示能使苯胺蓝平板上产生褪色圈的有6株菌，其中脱色圈范围大于1 cm的有4株，编号为LQ-01、LQ-02、LQ-03与LQ-04；在α-萘酚选择平板上产生紫色圈的有3株，其中变色范围明显的有2株，编号为LQ-03与LQ-04；在氯化锰鉴定选择上产生棕色圈有2株，其中变色范围明显的仅有1株，编号为LQ-04；菌株LQ-04在3种选择平板有比较明显的颜色反应，而菌株LQ-03在苯胺蓝与α-萘酚中有变色反应，揭示这2个菌株可能有降解产木质素的能力.将菌株LQ-03与LQ-04接种到木质素磺酸钙降解复筛培养基内，培养10 d检测发现对木质素磺酸钙均有一定的降解作用，降解率分别为8.2%和15.6%.从菌落形态上来看，菌株LQ-03和LQ-04都属于霉菌.因此，以降解活性较高的菌株LQ-04为目标菌株研究其产酶特性.2.2 LQ-04产酶特性研究2.2.1 生长产酶曲线测定LQ-04中LiP、MnP和Lac三种酶酶活及菌株生物量随时间的变化曲线，见图1.结果表明，菌体在60 h时进入稳定期，此时菌体生物量最高；LiP在60 h具有最大酶活达24.8 U/mL，MnP和Lac在72 h具有最大酶活分别为6.8 U/mL和16.7 U/mL，Lac和MnP在平台期后菌丝生长缓慢时才表现酶活性，这表明二者的合成与菌体的生长是非偶联的，属于滞后合成型酶，而LiP的产生和菌株的生长则为同步的.同时，LiP比MnP和Lac具有较高的酶活力，可推测LQ-04主要是通过分泌LiP对木质素进行降解，因此，选择对LiP酶活的测定来作为后面产酶优化的依据，并确定最适培养时间为60 h.2.2.2 碳源对产酶条件影响设置不同碳源(浓度20 g/L)接种LQ-04于32 ℃，150 r/min摇床培养60 h，见图2.结果表明，LQ-04在葡萄糖为碳源条件培养下，具有最大酶活力为42.6 U/mL，其次是蔗糖和麦芽糖，因此葡萄糖作为LQ-04产酶最适碳源.设置不同葡萄糖浓度于上述条件下进行摇床培养60 h.由图3可知当葡萄糖浓度为10 g/L时，其酶活最高达到为51.2 U/mL；随着葡萄糖浓度升高，酶活逐渐降低，在40 g/L时，酶活最低为10.6 U/mL，可能葡萄糖浓度过高多产酶有一定的抑制作用，因此选10 g/L作为葡萄糖的最适浓度.2.2.3 氮源对产酶条件影响设置不同氮源(浓度1 g/L)，在上述条件下培养60 h，见图4.结果表明，当LQ-04以牛肉膏为氮源时，具有最大的酶活50.1 U/mL，其次为蛋白胨，氯化铵酶活最低为6.5 U/mL.因此，将牛肉膏作为最适氮源.设置不同牛肉膏于上述条件下进行摇床培养60 h.由图5可知，当牛肉膏浓度为10 g/L 时，其酶活最大为55.8 U/mL，高于或者低于此浓度酶活力都下降，这可能是因为牛肉膏浓度的过高或过低抑制了菌株LQ-04的产酶能力.因此，将10 g/L牛肉膏作为最适产酶浓度.2.2.4 初始pH对产酶的影响设置不同初始pH值在上述条件下培养60 h.菌株产酶能力受到环境因子的影响较明显，为此初始pH值会直接影响菌株LQ-04的生长状况和发酵产酶的代谢动力学.由图6所示，当培养基初始pH值6.0时，LQ-04的产酶的活性最高为66.5 U/mL，pH值高于或低于6.0，LQ-04产酶的能力均受到不同程度的影响，尤其是pH值低于5.0时菌株LQ-04不但生长程度较慢，而且产酶能力降低较快.因此，产酶最适pH为6.0.2.2.5 温度对产酶的影响设置培养温度不同在上述条件下培养60 h，见图7.结果表明，在15～40 ℃范围内，酶活随着温度的升高而不断增大，当温度升至40 ℃时，菌株达到最大的产酶能力，酶活达到71.6 U/mL，40 ℃后酶活开始下降较快，这可能是由于随着温度的上升，酶结构受到影响，导致酶活降低.因此，选择40 ℃作为发酵产酶的最徍温度.2.2.6 转数对产酶的影响设置培养转数不同在上述条件下培养60 h，见图8.结果表明，随着转数升高其酶活逐渐升高，当转速达到为180 r/min时，菌株酶活达到峰值为78.2 U/mL，转速变小不利于LQ-04对酶的合成和分泌，它的生长和代谢活动得不到充足的氧气供应，因此酶活较低，当转数达到200 r/min酶活反而降低，可能转数过高其机械剪切力容易造成酶结构的破坏和酶活性的减弱或丧失[4].因此，选择180 r/min作为产酶最适转数.总之，在上述优化条件下，即在10 g/L葡萄糖，10 g/L牛肉膏，pH 6.0和转数为180 r/min条件下，将接种LQ-04后于40 ℃恒温摇床上培养60 h.进行5个平行实验，测定LiP酶活平均达到了82.8 U/mL，同时测定MnP为9.3 U/mL和Lac为23.6 U/mL.通过对在多年存放堆积的腐竹中筛选、分离纯化后获得纯菌株，选择其中变色反应比较明显，况且变色圈明显大于菌落直径的菌株，最终获得产酶能力较强的菌株LQ-04.对其产酶条件进行了优化，在培养基中葡萄糖10 g/L，牛肉膏10 g/L，初始pH值为6.0，温度为40℃，转速为180 r/min条件下培养，测定LiP酶活平均达到了82.8 U/mL，可作为液体培养产酶的最适工艺条件.。
高效木质素降解菌株的分离筛选与鉴定
高效木质素降解菌株的分离筛选与鉴定常燕;卢晓凤;王兆慧【摘要】为提高农作物秸秆中木质素的降解速度,从腐烂的树枝和土壤中筛选出一株高效降解木质素的菌株.结果表明,该菌株18S rDNA序列与二年残孔菌(Abortiporus biennis)有高度的同源性,结合其形态特征,初步鉴定该菌株为二年残孔菌,命名为H.%In order to increase crop stalk degradation, one strain of ligninase-producing epiphyte was selected from rotten plants and soil. The results showed that 18S rDNA sequence showed high homology with A bortiporus biennis, and in combination withmorphologic character,the strian was determined as A. biennis,named as H.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2017(056)018【总页数】3页(P3431-3433)【关键词】木质素;同源性;二年残孔菌(Abortiporusbiennis)【作者】常燕;卢晓凤;王兆慧【作者单位】南通大学生命科学学院,江苏南通 226019;南通大学生命科学学院,江苏南通 226019;南通大学生命科学学院,江苏南通 226019【正文语种】中文【中图分类】Q81农作物秸秆是农业生产中产生的一种重要的可再生性能源［1］，传统的方法将其进行焚烧或废弃，不仅浪费了资源还污染了环境。
如果将农作物秸秆先通过微生物的作用腐熟再还田，不仅可以改良土壤结构，使土壤物理性状更加趋于合理化［2-4］，还可以丰富土壤中微生物种群的数量和结构［5-7］，使农作物秸秆还田的意义更重大，也是目前利用秸秆资源最合理、最有效的方法。
产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化
产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化赵伟;王俐琼;郑甲;周洪波【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2010(033)003【摘要】从长沙岳麓山和湘江等地富含油脂的样品中分离得到一株产脂肪酶菌株CS 1-1,经18S rDNA序列分析,确定该菌株为黑曲霉(Aspergillus,niger).对该菌株的产酶条件进行优化,发现该菌株在以体积分数为1%的橄榄油为诱导物,5 g/L蔗糖为碳源,40 g/L蛋白胨为有机氮源,1 g/L(NH4)2SO4为无机氮源,pH为6.5的培养基中,于28℃,180 r/min摇床培养48 h,可达最大酶产量(37.6±0.8)mmol·min-1·L-1.【总页数】5页(P88-92)【作者】赵伟;王俐琼;郑甲;周洪波【作者单位】中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083;中南大学资源加工与生物工程学院,中国,长沙,410083【正文语种】中文【中图分类】Q939【相关文献】1.产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化 [J], 胡珺;杜新凯;王常高;林建国;杜馨;蔡俊2.产脂肪酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化 [J], 黎小军;谢莲萍;刘建宏;朱婷婷;刘蓉3.一株产脂肪酶细菌的分离鉴定及产酶条件优化 [J], 刘晓丽;杨孝朴;赵军4.产脂肪酶菌株C7828-5的筛选、鉴定以及产酶条件的优化 [J], 麻琼丽;张家明5.产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化 [J], 吴子君;陈思沅;杜昭君;胡双;李海峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一株甲苯高效降解菌的分离鉴定及降解特性
一株甲苯高效降解菌的分离鉴定及降解特性
吴欢;林小英;郭涛;牛佳;张迪迪
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2024(41)2
【摘要】为解决甲苯排放造成的环境污染问题,从家具厂附近的土壤中筛选出一株能以甲苯为单一碳源的降解菌,经形态特征和16S rDNA分析,鉴定为假单胞菌属,命名为Pseudomonas sp. M1。
通过单因素实验对菌株的生长条件进行优化,并在最适生长条件下考察菌株对不同底物利用的广谱性和表面活性剂对菌株生长降解的影响。
结果表明,菌株M1对甲苯有较强的耐受性,在30℃、pH 7.0、甲苯质量浓度200 mg/L的条件下,3 d后降解率达到63.03%。
除甲苯外,M1还能以苯、乙醇为碳源和能源,在苯、甲苯、乙苯、二甲苯的复合污染物下,依然可以保持一定的生长量。
非离子表面活性剂TritonX-100具有适度的可生物降解性,对甲苯降解的促进效果最好,在100 mg/L甲苯质量浓度下,添加0.5倍临界胶束浓度的TritonX-100后甲苯降解率为93.35%。
【总页数】5页(P63-66)
【作者】吴欢;林小英;郭涛;牛佳;张迪迪
【作者单位】福建工程学院生态环境与城市建设学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.112;X172
【相关文献】
1.一株苯乙烯高效降解菌的分离鉴定及降解特性研究
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几种食用菌产胞外纤维素酶对比及其产酶条件的优化
几种食用菌产胞外纤维素酶对比及其产酶条件的优化丁玉萍;韩诚武;赵永勋;申健;靖桂云;董良杰【期刊名称】《北方园艺》【年(卷),期】2012(000)023【摘要】利用刚果红杯碟快速筛选法对大白菇、金针菇、香菇、竹荪、磷盖红菇、杏鲍菇6种食用菌产纤维素酶能力进行了比较,同时对高产纤维素酶食用菌的最佳工艺条件进行了优化.结果表明:磷盖红菇出现透明圈最大,直径为20 mm;磷盖红菇产纤维素酶最佳工艺条件为摇床转速105 r/min,培养初始pH5.4,培养时间72 h,培养温度26℃.【总页数】3页(P119-121)【作者】丁玉萍;韩诚武;赵永勋;申健;靖桂云;董良杰【作者单位】佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学生命科学学院,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】S646.120.4【相关文献】1.豆渣深层培养滑菇产胞外纤维素酶最佳培养基的优化 [J], 韩诚武;丁玉萍;申健;牛佳田;翟登攀;孟宪超2.一株产纤维素酶的暹罗芽孢杆菌筛选及产酶条件优化 [J], 沙沙;刘心怡;张玉林;邢翔3.西藏热泉1株产纤维素酶真菌的鉴定及产酶条件优化 [J], 卢雨欣; 赵航轲; 唐小飞; 刘开辉; 邓百万; 丁小维4.一株产纤维素酶细菌的发酵产酶条件优化 [J], 郭建华; 张春强; 郭宏文; 邹东恢; 王燕; 韩国栋; 马瑞5.海洋产纤维素酶草螺菌的筛选及产酶条件优化 [J], 姜乃文;薛永常因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木质素降解真菌菌群LDFC产酶条件优化
木质素降解真菌菌群LDFC产酶条件优化王敬红;李灵灵;申贵男;袁媛;曹迪;高亚梅;晏磊;王伟东【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》【年(卷),期】2022(34)2【摘要】把菌株BYL-3(Trametes hirsuta)、BYL-7(Trametes versicolor)和BYL-8(Trametes hirsuta)三株具有木质素分解能力的真菌混合培养,构建了具有更高木质素降解能力的真菌菌群LDFC。
为获得菌群LDFC的最佳产酶条件,从碳源种类、氮源种类、Cu^(2+)浓度、Mn^(2+)浓度和诱导剂种类五个方面进行优化。
LDFC的最佳产酶条件为添加麦芽糖为复合碳源,硝酸钠为氮源,Cu^(2+)浓度为1.5 mmol·L^(-1),Mn^(2+)浓度为0.2 mmol·L^(-1),ABTS为诱导剂,优化后漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)的酶活性分别为678.3、1463.6、2667.8 U·L^(-1),与优化前相比分别提高142.8%、49.0%、110.0%。
试验为利用多菌株协同降解木质素的研究和后续应用提供数据支持。
【总页数】7页(P75-80)【作者】王敬红;李灵灵;申贵男;袁媛;曹迪;高亚梅;晏磊;王伟东【作者单位】黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源利用重点实验室/黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院;粮食副产物加工与利用教育部工程中心【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.食用菌木质素降解菌的筛选及产酶条件优化2.白腐菌Pleurotus eryngii-Co007产木质素降解酶条件的优化3.木质素降解真菌的分离与相关酶活性测定及产酶条件优化4.木质素降解菌的筛选及产漆酶培养条件的优化5.响应面法优化白腐菌Pleurotus eryngii_(-Co007)产木质素降解酶条件因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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浙 江 农 林 大 学 学 报 ，２ １ ，２ （ ） ４ ０ ２ ９ ２ ：２ ４—２ ０ ５
Ｊｕｎｌ ｆＺ ｅｉ ｇＡ＆ＦＵ ｉ ｒｉ ｏ ｒａ ｏ ｈｊ ｎ ａ ｎ ｅｓ ｙ ｖ ｔ
雷竹 林存 留有机覆盖物高效 降解 菌株 分离及产 酶条件优化
可 晓ｌ，陈双林 １ ，张小平 ，郭子 武
选 出有 机覆 盖物 高效 降 解菌株 １株 （ 菌株 ２１ 。经 茵落形 态和 生物 学特性 分析 ，菌株 ２１属青 霉属 Ｐ ｎｃｌｕ ．） ． ｅ ｉｉｉｍ，最佳 ｌ 产酶 条件 为起 始 ｐ ．，培 养 温度 ３ Ｈ ５０ ０℃ ，培 养 时 间 ５ｄ ，碳 源为稻 草 秸秆 粉 ２ ． ・～，氮源 为牛 肉 膏 ２５ ・ ， ５０ ｇ Ｌ ０ ．０ｇ Ｌ
Ｃ ｌ ｇ ｆＲｅ ｏ ｒｅ ｎ ｎ ｉｏ ｍｅ ｔ ｉｈ ａ ｒ ｕ ｕ ａ ｉｅ ｓｔ ｏｌ ｅ ｏ ｓ ｕ ｃ ｓａ ｄ Ｅ ｖ ｒ ｎ ｎ ，Ｓ ｃ ｕ ｎ Ａｇ ｉ ｈ ｒ ｌ ｅ ｃ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ ｙ，Ｙａ’ ｎ ６ ５ ４， Ｓｃ ｕ ｎ ａ ２ｅ ｓ ｏｏｙｍｏｐ ｏｏｙａ ｄｂｏ ｇｃｌ ｈ ｒｃｅｉ ｉ ｅｅ ｓｄｆｒｈ ｎ ｌ ｉ Ｒ ｎｙ ｃｉ ｔ Ｆ Ａ） ｓ ｌａ ｌ ｒｈ ｌｇ ｎ ｉｌ ｉ ａａｔｒ ｔ ｓ ｒ ｅ ｅ ａｙ ｓ ｅ ｖｙ ｗ ｌ ｃ ｎ ｏ ａｃ ｓｃ ｗ ｕ ｏｔ ａ ｓ．
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（ ． 国林 业 科 学研 究 院 亚 热 带林 业 研 究 所 ，浙 江 富 阳 ，３ １ ０ ；２ 四Ｊｌ 业 大 学 资源 与环境 学 院 ， １中 １４ ０ ． Ｉ 农
四川 Ｉ雅 安 ６ ５ １ ） ２ ０ ４
摘 要 ：有机 覆 盖物 林 地 大量 存 留是 雷竹 Ｐ ｙｌｓ ｃ ｙ ｉ ａｃ ｎ ｈ ｌ ｔ ｈｓｖｏ ｓｅｓ林 退化 的主要 原 因之 一 。为人 ２ 促 进 有机 覆 盖 物 高 ｏａ ｌ ７ －
效 腐 解 ．为有 机覆 盖 物促 腐制 剂研 制 提供 前期研 究基 础 ，采 用稀 释 涂平 板 法和 富集 培养 法从 雷竹林 地 覆 盖有 机材
料 （ 糠 、稻 草 ） 雷 竹 林 土 壤 中 ，初 选 出具 有 较 强 纤 维 素 酶 活 力 的 菌 株 ７株 ，其 中 ， 真 菌 ４株 ，放 线 菌 ３株 ， 复 砻 和
Ｓ ｌｃ ｉｎ ｏ ｔａｎ ｓ ｄ ｔ ｅ ｒ ｄ ｒ ａ ｉ ｌ ｈ ｎ ｔ ｒ ｌ ｒ ｍ ｅｅ ｔ ｆｓｒ ｉ ｓｕ ｅ ｏ ｄ ｇ ａ ｅ ｏ ｇ ｎ ｃ ｍｕ ｃ ｉ ｇ ｍａｅ ｉ ｓｆｏ ｏ ａ Ｐ ｙ ｌｓａ ｙ ｌｓ ｓ ｆｒ ｓ ａ ｄ ｏ ｔ ｚ ｔ ｎ ｏ ｓｅ ｚ ｍｅ ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｈ ｌ ｃ ｓ ｖｏ ａ ｏ ｅ ｔ ｎ ｐ ｉ ａｉ ｆｉ ｎ ｙ ｒ ｄ ｃｉ ｏｔ ｈ ｉ ｃｎ ｅ ｍｉ ｏ ｔ ｏ
无机 盐为 氯化铁 （ ｅ １ ０ １ｇ Ｌ Ｆ Ｃ ３ ． ・ 和磷 酸二 氢钾 （ Ｈ Ｐ ４１ ０ｇ Ｌ 图 ４表 ３参 ２ ）０ Ｋ ２Ｏ ）． ・－ ５ 。 ０ 关键词 ：微 生 物学 ；雷竹 ；有机 覆盖 物 ；降解 菌株 ；纤 维素 降解酶 ；产 酶条件
中 图 分 类 号 ：￥ ９ ． ７ ５７ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：２ ９ —７ ６ ２ １ ）２０ ４ ．７ ０ ５０ ５ （ ０ ２ ０ —２ ４０
ＫＥ ａ Ｘｉ ｏ 一， ＣＨＥＮ ｈ ａ ｇ ｆｎ ， ＺＨＡＮＧ ａ — ｎ ＧＵＯ — Ｓｕｎ－ ｉ Ｘｉｏ ｐｉ ｇ ， ＺｉＷＵ
（ ． ｅｅｒｈＩｓｔｔ ｏ ｕ ｔ ｐ ａ Ｆ ｒｓｙ ｈｎｓ ｃｄ ｍ ｆ ｏｅｔ ，Ｆ ｙｎ １４０ ｈｊ ｎ ，Ｃ ｉａ ． １ Ｒ ｓａｃ ｔｕｅ ｆ ｂｒ ｉ ｌ ｏｅｔ ，Ｃ ｉｅｅＡ ａ ｅ ｙｏ ｒｓ ｎ ｉ Ｓ ｏ ｃ ｒ Ｆ ｙ ｒ ｕ ａｇ３ １０ ，Ｚ ｅａ ｇ ｈｎ ；２ ｉ
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