地黄饮子调节海马神经突触可塑性作用机制研究

地黄饮子调节海马神经突触可塑性作用机制研究
李少创1，2，韩 诚1，2，张 正1，2，赵雅飞1，2，秦亚莉1，2，刘 昕1，2，贺文彬1，2，张俊龙1，
2
（1.山西中医药大学分子中医药学国家级国际联合研究中心，山西 太原 030024；
2.山西中医药大学中医脑病学山西省重点实验室，山西 太原 030024）
［摘要］ 目的：观察地黄饮子改善阿尔茨海默病（AD ）模型小鼠学习记忆能力及对海马突触可塑性的影响，探讨AD 治疗机制。

方法：选用50只6月龄SAMP8小鼠构建AD 动物模型，采用RANDBETWEEN 随机函数将其分为模型组、盐酸美金刚组及地黄饮子低、中、高剂量组各10只，选用同龄SAMR1小鼠10只作为正常组。

地黄饮子各剂量组及盐酸美金刚组按照给药剂量给予相应药物灌胃，正常组和模型组给予等体积纯水灌胃，连续给药12周。

新物体识别、Morris 水迷宫、巴恩斯迷宫法分别检测小鼠的学习记忆能力，在体海马场电位实验记录小鼠海马长时程增强（LTP ）效应，免疫组化实验检测突触后致密蛋白-95（PSD -95）、突触素（SYN ）蛋白水平的变化，蛋白质印迹法检测海马神经元NMDAR1、NMDAR2B 、Ca 2+在细胞内所结合钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）蛋白表达情况。

结果：与模型组比较，地黄饮子各剂量组小鼠新物体识别系数增加，差异有统计学意义（P ＜0.001）；在目标象限停留时间明显增加，差异均有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01），且平台穿越次数增加，逃避潜伏期缩短；进入逃生箱所需时间减少，但差异无统计学意义（P ＞0.05），在逃生箱所在象限停留时间明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

在体海马场电位记录实验表明，高频刺激前各组小鼠fEPSPs 斜率无明显差异，高频刺激后30 min 、60 min 地黄饮子各剂量组较模型组斜率增高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

与模型组比较，地黄饮子各剂量组CA1区海马神经元PSD -95蛋白、SYN 蛋白表达水平上升；地黄饮子各剂量组CA3区海马神经元PSD -95蛋白、SYN 蛋白表达水平上升。

与模型组比较，地黄饮子各剂量组海马神经元CaMKⅡ、NMDAR1、NMDAR2B 蛋白表达水平升高。

结论：地黄饮子能改善AD 模型小鼠的学习记忆能力，机制可能为通过调节海马神经元Ca 2+维持神经突触可塑性，。

［关键词］ 阿尔茨海默病；地黄饮子；海马；突触可塑性；长时程增强效应；钙离子；小鼠；学习记忆能力［中图分类号］ R289.1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007-659X （2024）03-0337-11 DOI ：10.16294/ki.1007-659x.2024.03.012
Mechanism of Dihuang Drink （地黄饮子） Regulating Synaptic Plasticity in Hippocampus
LI Shaochuang 1，2，HAN Cheng 1，2，ZHANG Zheng 1，2
，ZHAO Yafei 1，2，QIN Yali 1，2，LIU Xin 1，2，HE Wen⁃bin 1，2，ZHANG Junlong 1，
2（1.National International Joint Research Center of
Molecular Traditional Chinese Medicine ，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine ，Taiyuan 030024，China ；2.Shanxi Key Laboratory of Traditional
Chinese Medicine Encephalopathy ，Shanxi Univer⁃［收稿日期］ 2023-05-16
［基金项目］ 国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点项目（编号：U21A20410）；国家自然科学基金项目（编号：81874420，81703959，82004236）；山西省重点研发计划（国际科技合作）重大区域创新合作项目（编号：201803D421006，201903D421018）；山西省基础研究计划项目（编号：202203021211222）；山西省教育厅自然科学类项目（编号：2020L0405）；山西中医药大学2021年研究生创新创业项目（编号：2021CX020） ［作者简介］ 李少创（1993—），男，河北邯郸人，2020年级硕士研究生，研究方向：中医基础理论研究。

电话：157****3055；邮箱：shao ****************。

［通信作者］ 张俊龙（1963—），男，山西吉县人，医学博士，教授，博士研究生导师，主要从事中医藏象理论研究。

电话：0351-*******；邮箱：**********************。

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山东中医药大学学报
阿尔茨海默病（AD）是一种认知和记忆功能遭到严重破坏的神经退行性疾病，伴随严重的突触可塑性损害［1］。

随着中国老龄化人口的快速增加，解决这一极具挑战性的全球性疾病愈发迫切［2］。

目前，AD的主要病理特征包括β-淀粉样蛋白变性、神经原纤维缠结、神经元丢失，伴有脑血管淀粉样变性、神经炎症反应以及重大突触改变等［3］。

海马是大脑中与学习和记忆密切相关的结构基础，在AD发病早期阶段，可出现海马损害。

突触是神经系统中信息传递的关键媒介，是神经元之间通讯的微小单元，Ca2+可以介导突触信号通道的开放，在信息传递及记忆形成过程中发挥至关重要的作用［4］。

地黄饮子出自《黄帝素问宣明论方》，具有补肾填精益髓之功效。

临床研究发现，地黄饮子可显著改善AD患者症状［5］。

实验证明，地黄饮子通过突触保护作用，避免神经元凋亡［6］，并具有调节突触可
sity of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China）
Abstract Objective：To observe the effect of Dihuang Drink（地黄饮子）on improving learning and memory ability and hippocampal synaptic plasticity in model mice with Alzheimer’s disease（AD），and to explore the mechanism of AD treatment. Methods：Total 50 6-month-old SAMP8 mice were selected to construct AD animal model，and they were divided into model group，memantine hydrochloride group，Dihuang Drink low-dose，medium-dose and high-dose groups by RANDBETWEEN random function，and 10 SAMR1 mice of the same age were selected as normal group. Dihuang Drink groups and memantine hydrochloride group were given corresponding drugs by gavage，and normal group and model group were given equal volume of pure water by gavage for 12 weeks. The learning and memory ability of mice was detected by new object recognition，Morris water maze and Barnes maze respectively. The long-term potentiation（LTP）effect of hippocampus was recorded by field potential experiment. The changes of postsynaptic density protein-95（PSD-95）and synapsin（SYN）protein levels were detected by immunohistochemical experiment. The protein expression of NMDAR1，NMDAR2B and Ca2+-binding calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ（CaMKII）in hippocampal neurons were detected by Western blotting method. Results：Compared with the model group，the new object recognition coefficient of mice in the Dihuang Drink groups was increased，and the difference was statistically significant（P<0.001）；the time of staying in the target quadrant was significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.05，P<0.01），and the number of platform crossing was increased，and the escape latency was decreased；the time required to enter the escape box was reduced，but the difference was not statistically significant（P>0.05），and the time of staying in the quadrant of the escape box was significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.05）. The in vivo hippocampal field potential recording experiment showed that there was no significant difference in the slope of fEPSPs in each group of mice before high frequency stimulation，and the slope of the Dihuang Drink groups was significantly higher than that of the model group 30 min and 60 min after high frequency stimulation（P<0.05）. Compared with the model group，the expression levels of PSD-95 protein and SYN protein in hippocampal neurons in CA1 region of the Dihuang Drink groups were increased；the expression levels of PSD-95 protein and SYN protein in hippocampal neurons in CA3 region of the Dihuang Drink groups were increased. Compared with the model group，the expression levels of CaMKII，NMDAR1，NMDAR2B protein in hippocampal neurons in the Dihuang Drink groups were increased. Conclusions：Dihuang Drink can improve the learning and memory ability of AD model mice，and the mechanism may be through regulating the Ca2+in hippocampal neurons to maintain synaptic plasticity.
Keywords Alzheimer’s disease；Dihuang Drink（地黄饮子）；hippocampus；synaptic plasticity；long-term poten⁃tiation；calcium ion；mice；learning and memory ability
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塑性、增强学习记忆作用［7］。

但地黄饮子调节突触可塑性的机制尚不明晰。

本实验围绕突触可塑性形成相关机制，通过观察长时程增强（LTP）效应、突触功能相关蛋白突触后致密蛋白-95（PSD-95）、突触素（SYN），Ca2+进入细胞的主要通道蛋白N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR），以及Ca2+在细胞内所结合钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的变化，初步探究地黄饮子是否通过调节海马神经元Ca2+维持神经突触可塑性以改善学习记忆能力。

1 材料
1.1 实验动物
13周龄SPF级雄性SAMP8快速老化小鼠50只和其同源正常老化SAMR1小鼠10只，购买于北京大学（实验动物科学部），生产许可证号：SCXK（京）2016-0010。

单笼饲养于山西中医药大学实验管理中心屏障环境。

实验期间，动物可以自由饮食饮水，温度控制在（22±2）℃，相对湿度控制在40%～60%，照明每12 h明暗交替一次。

本实验涉及实验动物研究内容和过程均符合国家对医学实验动物的相关要求，伦理审查编号：AWE20221201。

1.2 药品
地黄饮子全方由熟地黄12 g、巴戟天9 g、山茱萸9 g、石斛9 g、肉苁蓉9 g、炮附子6 g、五味子6 g、肉桂6 g、茯苓6 g、麦门冬6 g、石菖蒲6 g、远志6 g、薄荷3 g组成，购买于北京同仁堂（晋中店），经山西中医药大学中医脑病实验室中药学专业李钦青副教授鉴定为正品。

按以下方式对中药饮片进行煎煮：经称量后每剂中药为93 g，加入5倍纯水，浸泡1 h，煎煮30 min为一煎，倒出药液后再次加入5倍纯水，煎煮30 min，将2次煎煮液充分混合，并浓缩至46.5 mL，即1 mL药液含2 g生药，冷却后放入4 ℃冰箱备用。

阳性药盐酸美金刚片（丹麦灵北药厂）配置成0.5 mg/mL 的混悬液。

1.3 试剂
增强型RIPA裂解液（批号17F01A02）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号17C17B46）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号17F14B38）、正常山羊血清（批号AR1009）均购自武汉博士德生物工程有限公司；
0.9%氯化钠注射液（批号H13023200）购自石家庄四
药有限公司；注射用青霉素钠（批号7107302）购自华
北制药有限公司；乌来糖（批号330H032）购自北京索
莱宝科技有限公司；水合氯醛（批号Z31M9Y62727）
购自上海源叶生物科技有限公司；4%多聚甲醛（批
号20190408）购自国药集团化学试剂有限公司；柠
檬酸盐缓冲液（批号ZLI-9065）、DAB试剂盒（批号ZLI-9018）购自北京中杉金桥生物有限公司；PSD-95（批号20665-1-AP）抗体购自Proteintech公司；SYN
（批号Ab32127）抗体、NMDAR1（批号ab193310）、NMDAR2B（非磷酸化抗体，批号ab93610）、CaMKⅡ抗体（批号ab181052）均购自Abcam公司；羊抗兔二抗（批号BST17GO4A17H50）购自武汉博士德生物工程有限公司；β-actin一抗（批号AC038）、二抗（批号AS014）均购自ABclonal公司。

1.4 仪器
DigBehv动物行为分析系统购自上海吉量软件科技有限公司；1440B型digidata数模/模数转换器购自美国/Axon公司；MASTER-8可编程刺激器购自以色列/A.M.P.I公司；金属微电极（记录电极：TM33B01；刺激电极：TM33CCN0N）、68306型脑立体定位仪购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；DP80显微镜购自日本Olympus公司；Heraeus Multifuge X1R 高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技公司；Milli-Q Plus超纯水系统购自Millipore公司；DYY-7C型垂直转移电泳仪购自北京六一仪器厂；JY92-IIN超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Champ Chemi Professional凝胶成像系统购自北京赛智创业科技有限公司。

2 方法
2.1 动物分组及给药
使用RANDBETWEEN随机函数将50只SAMP8
小鼠构建AD模型后分为5组，即模型组、地黄饮子
低剂量组、地黄饮子中剂量组、地黄饮子高剂量组、
盐酸美金刚组，每组10只；将10只同龄SAMR1小鼠
作为正常组。

所有小鼠从6月龄开始灌胃，根据人与
小鼠体表面积折算给药剂量，将人鼠等比例中药剂量
定为中剂量，即18.6 g/kg［8］。

得到地黄饮子低剂量组灌胃剂量为9.3 g/kg，地黄饮子高剂量组灌胃剂量为37.2 g/kg，盐酸美金刚组灌胃剂量为0.004 g/kg。

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正常组和模型组给予等体积纯水，每日1次，连续给药12周。

2.2 动物处理及组织取材
灌胃6周后，进行行为学测试。

灌胃12周后进行小鼠在体海马场电位记录实验，结束后取材。

将小鼠麻醉后，在冰盒上快速取脑并迅速剥离出海马，液氮处理后分装，存放于-80 ℃冰箱。

灌胃过程中，正常组和地黄饮子高剂量组小鼠各死亡1只，将各组动物数量统一为9只。

2.3 实验方法
2.3.1 新物体识别实验
实验分为3个阶段，共3 d完成。

第1天将小鼠放入50 cm×50 cm×45 cm的场地中，无任何物体在场地当中，让小鼠自由活动10 min，熟悉场地环境；第2天，将小鼠放入含有两个体积、材质、颜色等相同物体（A1、A2）的场地中活动10 min；第3天将场地中的物体A2换成材质、颜色、气味相同，但形状不同的另一物体B，并让小鼠在其中探索10 min，记录10 min内小鼠对物体A1、B的探索时间及探索次数。

新物体识别指数为DI=T B/（T B+T A1）×100%，新物体
识别次数为物体B识别次数减去物体A1识别次数（N=N B-N A1）。

2.3.2 Morris水迷宫实验
实验共分6 d进行。

前5 d为学习阶段，将水下平台置于第Ⅲ象限，将该象限定为目标象限。

平台上表面距离水面约2 cm，水温控制在22 ℃左右。

每天下午分两次将小鼠从第Ⅰ象限和第Ⅳ象限的中点放入，记录小鼠找到平台的时间（逃避潜伏期设定为90 s）。

若超时未找到水下平台，则需将小鼠轻轻引导到平台停留10 s。

第6天为测试阶段，撤走水下平台，将小鼠从第Ⅲ象限池壁中点放入，记录90 s内小鼠穿越原平台次数和在原平台所处象限停留时间。

2.3.3 巴恩斯迷宫实验
巴恩斯迷宫实验共8 d，分为习惯性阶段、训练阶段、测试阶段。

第一阶段为习惯性阶段，1 d。

80分贝噪音刺激下将小鼠放入巴恩斯迷宫当中进行自由探索1 min。

第二阶段为训练阶段，共6 d。

将小鼠放入起始盒，开启噪声5 s后提起起始盒，让小鼠在巴恩斯迷宫中自由探索3 min，如果3 min内小鼠没有找到逃生箱，则将小鼠轻轻引导到逃生箱并迅速关闭噪声让小鼠在逃生箱中停留30 s，每只小鼠每天重复2次。

第三阶段为测试阶段，1 d。

移除逃生箱，记录噪音刺激下小鼠在3 min时间内进入逃生箱所需时间（若超过3 min按3 min计算）以及在逃生箱所在象限停留时间。

2.3.4 小鼠在体海马场电位记录
在行为学测试后，用同样的小鼠记录在体海马LTP。

按1 g/kg腹腔注射复合麻药（水合氯醛：乌拉坦=1∶5，配置成20%复合麻药）麻醉，麻醉成功，将小鼠头部固定在脑立体定位仪上，之后剪开头部皮肤，使用牙科钻在颅骨上钻孔（前囟点后2.0 mm，中线外1.5 mm），插入固定好的刺激电极和记录电极，使刺激电极和记录电极分别位于Schaffer侧支和海马CA1区的辐射层。

通过测试刺激诱发场兴奋性突触后电位（fEP⁃SPs）。

首先记录30 min的fEPSPs，后给予一串200 Hz 高频刺激诱导LTP效应，至少记录60 min。

以高频刺激前30 min记录到fEPSPs斜率均数为100%，将所有fEPSPs进行标准化，用斜率百分比表示。

2.3.5 免疫组化实验
取4%多聚甲醛固定的小鼠脑组织，脱水后石蜡包埋，切片机切片（厚约5 μm），经二甲苯和梯度乙醇至水脱蜡。

将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），微波炉高火加热10 min进行抗原修复。

之后将切片放入3%双氧水中，室温10 min以阻断内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液进行封闭，滴加一抗，PSD-95（1∶50），SYN（1∶50），4 ℃过夜。

PBS洗涤后滴加对应二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，洗涤后DAB 显色。

苏木素染色，PBS洗涤后甘油封片，显微镜下观察切片，Image J软件分析光密度值。

2.3.6 蛋白质印迹实验
将冰冻的小鼠脑组织进行称重，按10 μL/μg加入裂解液，按1 μL/μg加入蛋白酶抑制剂，超声裂解后再在冰上裂解30 min，之后12 000 r/min离心30 min，取部分上清液做BCA蛋白浓度测定，其余部分加入1/4体积的蛋白上样缓冲液。

取制备好的蛋白样品进行电泳，电泳完毕后进行电转。

使用无蛋
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白快速封闭液进行封闭，孵育一抗，4 ℃下过夜。

TBST 洗涤3次后孵育对应二抗2 h ，之后进行显影。

最后用Image J 软件对蛋白条带的灰度值进行测定。

目标蛋白一抗使用情况：NMDAR1（1∶1 000），NMDAR2B （1∶1 000），CaMKⅡ（1∶1 000），内参β-actin
（1∶10 000）。

二抗：羊抗兔（1∶10 000）。

2.4 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.4.2软件进行数据统计分析，计量资料以x ±s 表示；多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，采用LSD 检验。

取α=0.05为检验水准。

3 结果
3.1 新物体识别实验结果
与正常组相比，模型组新物体识别系数明显减小，差异具有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组相比，地黄饮子各剂量组新物体识别系数明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.001），新物体识别次数有所增加，但差异无统计学意义（P ＞0.05）；盐酸美金刚组新物体识别系数和新物体识别次数均增加，差异有统计学意义（P ＜0.001，P ＜0.05）。

见图1。

3.2 Morris 水迷宫实验结果
与正常组比较，模型组在目标象限停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少，差异具有统计学意义（P ＜0.001），逃避潜伏期在第3天增加，差异有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01）。

与模型组相比，地黄饮子低剂量组在目标象限停留时间延长，穿越平台
次数增加，差异有统计学意义（P ＜0.05），逃避潜伏期在第5天有所缩短，但差异无统计学意义（P ＞0.05）；地黄饮子中剂量组在目标象限停留时间延长，差异有统计学意义（P ＜0.01），穿越平台次数有所增加，但差异无统计学意义（P ＞0.05），逃避潜伏期在第5天缩短，差异有统计学意义（P ＜0.05）；地黄饮子高剂量组在目标象限停留时间延长，差异有统计学意义（P ＜0.01），穿越平台次数有所增加，逃避潜伏期在第5天有所减少，但差异无统计学意义（P ＞0.05）；盐酸美金刚组在目标象限停留时间延长，穿越平台次数增加，差异均有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.05），逃避潜伏期在第5天有所减少，但差异无统计
学意义（P ＞0.05）。

见表1、图2。

3.3 巴恩斯迷宫实验结果
与正常组相比，模型组小鼠进入逃生箱所需时间增加，在逃生箱所在象限停留时间减少，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组相比，地黄饮子各剂量组和盐酸美金刚组进入逃生箱所需时间有所减少，但差异无统计学意义（P ＞0.05），在逃生箱所在象限停留时间均增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

见图3。

3.4 在体海马场电位记录结果
与正常组相比，模型组在高频刺激后60 min 斜率明显降低（P ＜0.05）。

与模型组相比，地黄饮子中剂量组在高频刺激后30 min 、60 min 时斜率明显增高（P ＜0.05）。

见图4。

注：与正常组比较，**P ＜0.01，***P ＜0.001；与模型组比较，#P ＜0.05，###
P ＜0.001。

图1 各组小鼠新物体识别实验结果比较（n =9）
李少创等：地黄饮子调节海马神经突触可塑性作用机制研究A
B
新物体识别系数
新物体识别次数
0.80.60.40.20
86420
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
341
2024年5月 第48卷第3期山东中医药大学学报3.5 免疫组化实验结果3.5.1 PSD -95蛋白免疫组化结果
与正常组相比，模型组CA1区海马神经元PSD -95蛋白表达水平下降，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组比较，地黄饮子低剂量组和盐酸美金刚组CA1区海马神经元PSD -95蛋白表达水平上升，差异有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.001），地黄饮
子中、高剂量组CA1区海马神经元PSD -95蛋白表达注：A 为各组小鼠第Ⅲ象限停留时间比较；B 为各组小鼠穿越平台次数比较。

与正常组比较，***P ＜0.001；与模型组比较，#P ＜0.05，##
P ＜0.01。

图2 各组大鼠Morris 水迷宫实验结果比较（n =9）
注：A 为各组小鼠进入逃生箱所需时间；B 为各组小鼠在逃生箱所在象限停留时间。

与正常组比较，***P ＜0.001；与模型组比较，###P ＜0.05。

图3 各组小鼠巴恩斯迷宫实验结果比较（n =9）
表1 各组小鼠逃避潜伏期比较（x ±s ） s
组别
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
注：与正常组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，#
P ＜0.05。

只数999999
逃避潜伏期
第1天
90.00±0.0090.00±0.0090.00±0.0087.04±8.8885.32±11.9890.00±0.00第2天
85.30±14.0989.66±1.0382.49±14.2080.37±13.3585.66±7.0285.77±12.69第3天
53.40±28.1187.35±7.96**76.65±14.8673.90±20.3779.37±13.4972.39±17.82第4天
52.12±22.2584.01±10.12**60.63±22.2363.51±26.9072.23±18.3566.12±14.77
第5天
40.97±25.0972.94±24.76*54.81±27.2754.04±28.89#
60.18±24.7261.86±21.03
B
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
A
A
B
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
时间/s
时间/s
时间/s
200150100500
200150100500
403020100
54
3210
穿越平台次数342
2024年5月 第48卷第3期注：A 为各组小鼠标准化斜率折线图；B 为各组小鼠时间节点标准化斜率比较。

与正常组比较，*P ＜0.001；与模型组比较，#P ＜0.05。

图4 各组小鼠在体海马场电位比较（n =9）
表2 各组小鼠海马PSD -95蛋白平均光密度值比较（x ±s ）
组别
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
注：与正常组比较，***P ＜0.001；与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###
P ＜0.001。

只数999999
CA1区
13.84±2.730.97±0.02***4.46±2.10#
2.60±0.362.50±0.508.54±0.85###CA3区
7.25±2.030.70±0.19***
2.47±1.241.17±0.22
3.95±0.48##
3.67±0.61#
图5 各组小鼠海马CA1区与CA3区神经元PSD -95蛋白免疫组化表达比较（×400）
李少创等：地黄饮子调节海马神经突触可塑性作用机制研究A
B
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
正常组
模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
150100500
200150100500
-30 0 30 60
刺激前 0 30 60
正常组 模型组 地黄饮子低剂量组 地黄饮子中剂量组 地黄饮子高剂量组 盐酸美金刚组
海马
CA1区
CA3区
兴奋性突触后电位斜率/%
时间/min 时间/min
兴奋性突触后电位斜率/%
343
2024年5月 第48卷第3期
山东中医药大学学报水平上升，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

与正常组相比，模型组CA3区海马神经元PSD -95蛋白表达水平下降，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组比较，地黄饮子低、中剂量组CA3区海马神经元PSD -95蛋白表达水平上升，差异无统计学意义（P ＞0.05）；地黄饮子高剂量组和盐酸美金刚组CA3区海马神经元PSD -95蛋白表达水平上升，差异有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.05）。

见图5、表2。

3.5.2 SYN 蛋白免疫组化结果
与正常组相比，模型组CA1区海马神经元SYN 蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组比较，地黄饮子低剂量组、盐酸美金刚组CA1区海马神经元SYN 蛋白表达水平上升，
差异有统计学意义（P ＜0.01），地黄饮子中、高剂量组CA1区海马神经元SYN 蛋白表达水平上升，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

与正常组相比，模型组CA3区海马神经元SYN 蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.001）。

与模型组比较，地黄饮子低、中剂量组和盐酸美金刚组CA3区海马神经元SYN 蛋白表达水平上
升，差异有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.05）；地黄饮子高剂量组CA3区海马神经元SYN 蛋白表达水平上升，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

见图6、表3。

3.6 各组小鼠NMDAR1、NMDAR2B 、CaMKⅡ蛋白表达含量比较
与正常组相比，模型组NMDAR1、NMDAR2B 、CaMKⅡ蛋白表达含量降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

与模型组相比，地黄饮子低剂量组NMDAR1、CaMKⅡ蛋白表达含量有所增加，差异无统计学意义（P ＞0.05），NMDAR2B 蛋白表达含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；地黄饮子中剂量
表3 各组小鼠海马SYN 蛋白平均光密度值比较（x ±s ）
组别 正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
注：与正常组比较，***P ＜0.001；与模型组比较，#P ＜0.05，##
P ＜0.01。

只数999999
CA1区
2.68±0.620.13±0.05***1.56±0.28##0.43±0.050.46±0.061.51±0.74##
CA3区
3.27±0.590.23±0.07***1.86±0.62##1.38±0.57#0.74±0.081.95±0.29##
图6 各组小鼠海马CA1区与CA3区SYN 蛋白免疫组化表达比较（×400）
正常组 模型组 地黄饮子低剂量组 地黄饮子中剂量组 地黄饮子高剂量组 盐酸美金刚组
海马
CA1区
CA3区
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2024年5月 第48卷第3期
组NMDAR1、NMDAR2B 、CaMK Ⅱ蛋白表达含量增加，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；地黄饮子高剂量组NMDAR1、NMDAR2B 、CaMKⅡ蛋白表达含量增加，差异均无统计学意义（P ＞0.05）；盐酸美金刚组NMDAR1、NMDAR2B 、CaMKⅡ蛋白表达含量增加，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

见图7。

4 讨论
AD 归属于中医学痴呆、呆病、健忘等范畴，其发
病主要病机为肾精亏虚［9］。

肾为先天之本，主藏精
化髓，髓通于脑，肾中精气充盈是脑进行精神活动的物质基础。

因此，肾中精气充足则脑髓充盈，脑得到充养则功能正常。

若肾精亏虚则脑髓失养，如《灵枢·海论》言：“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，解怠安卧。

”因此，肾虚精亏为AD 的核心病机，在治疗上应以补肾填精为主［10-11］。

地黄饮子临床常用于治疗AD 、血管性痴呆（VD ）等神经退行性脑病，该方可有效改善患者认知功能和日常生活能力［12-13］。

可见补肾填精、调补肾中阴阳能够健脑益智。

但地黄饮子补肾健脑的作用靶点在何处并不明确。

现代医学研究发现，AD 患者早期可出现明显记忆障碍，随着疾病发展会出现空间定向障碍。

影响记忆的关键组织是海马，任何一段记忆的形成都离不开海马，海马体积虽较小，但可对外部输入信息进
行快速编码完成信息存储［14］。

失去海马功能的人会
经常性遗忘，且无法形成新的记忆。

突触可塑性是指突触前神经元和突触后神经元之间连接强度改变，海马神经细胞间的突触连接使大脑学习和记忆成为可能。

学习新知识或记住学过的东西时，突触连接强度发生改变，学习和记忆得以实现。

LTP 是
突触可塑性的重要表现形式之一［15］，LTP 在神经元
中表达的一个重要因素是突触后细胞钙浓度的增加，钙离子通过NMDA 型谷氨酸受体大量内流诱导LTP 的产生，使突触传递效能增强。

4.1 地黄饮子能够改善AD 模型小鼠的学习记忆能力
新物体识别实验利用啮齿动物天生喜欢新奇事物的特性，通过观察其辨别新旧物体行为间接推测认知能力，是一种常用有效且无负性影响的记忆测
试实验［16］。

本实验发现模型组小鼠学习记忆能力明
注：A 为蛋白质印迹法检测钙离子相关蛋白表条带图，B 为NMDAR2B 蛋白表达含量比较，C 为NMDAR1蛋白表达含量比较，D 为CaMKⅡ蛋白表达含量比较。

与正常组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#
P ＜0.05。

图7 各组小鼠NMDAR1、NMDAR2B 、CaMK Ⅱ蛋白表达含量比较（蛋白质印迹法，n =3）
李少创等：地黄饮子调节海马神经突触可塑性作用机制研究1.5
1.20.90.60.30.0
1.5
1.20.90.60.30.0
正常组模型组
地黄饮子低剂量组地黄饮子中剂量组地黄饮子高剂量组盐酸美金刚组
1.51.20.90.60.30
NMDAR2B NMDAR1CaMKⅡβ-actin
166 kDa
105 kDa 56 kDa 42 kDa
N M D A R 1/β-a c t i n
C a M K Ⅱ/β-a c t i n
N M D A R 2B /β-a c t i n
A
D C
B 345。