重离子束辐照阿维菌素菌种选育与发酵工艺优化

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2023年4月下 第08期 总第404期
学术研究
China Science & Technology Overview
0.引言
阿维菌素是一种生物农药，符合世界农药发展趋势和
我国产业政策。

被广泛用于动植物病害防治，是主要的生物农药和兽药品种之一，作为推荐使用的高效低毒的农药产品，具有较好的市场前景。

菌种选育常用的方法包括化学诱变、r-射线辐照诱变、基因重组等，重离子束辐照诱变具有周期短、稳定性好等优点，诱变选育阿维菌素菌种，不仅可以提高阿维菌素的产能，还使有效组分
AVMB1a 组分比例显著提高。

1.菌种选育
利用中国科学院近代物理研究所中重离子束辐照诱
变的高产菌株。

首先在实验室对小 试基本条件进行验证，分别从温度、湿度、摇床转速、振幅、摇瓶容积、装液量等方面进行试验，确保实验室条件满足小试需求，再对重离子束诱变获得的菌株进一步分离纯化及筛选，获得性能
相对稳定的高产菌株[1]。

1.1分离纯化
将出发菌种铲取0.2cm 2～0.5cm 2大小菌苔制备单孢子
菌悬液备用。

用十倍稀释法一次做10-2、10-3、10-4、10-5梯度。

用吸管吸取稀释液，滴加1滴（约0.3ml ～0.5ml）于各个平板中，涂布10-3、10-4、10-5梯度。

27.5℃±0.5℃恒温
培养6d ～7d 后保存备用。

1.2 初筛
挑选草帽型（如图1所示为菌落形态）、灰白色、饱
满、较圆、直径0.25mm 以上形态较好的单菌落均匀涂
于斜面。

27.5℃±0.5℃，湿度30%～40%，6d ～7d 后斜面具有如下特征：斜面表面全部长满均匀一致、灰白色孢子，斜面背面有微黄色色素扩散至琼脂中。

培养成熟的斜面保存备用。

种子摇瓶培养：250ml 三角瓶，装量40ml。

铲取F1
代斜面0.5cm 2～1cm 2左右到种子摇瓶中，每支斜面接
一支摇瓶。

恒温27.8℃～28.2℃，转速260转/min，振幅2.5cm，培养28h 后摘下备用。

发酵瓶培养：为250ml 三角瓶，装量为40ml。

取一级
种1.6ml （接种量为4%）至发酵瓶中，恒温27.8℃～28.2℃，转速250转/分，振幅3.0cm。

发酵瓶培养256h 后测效价。

通过发酵过程中菌丝形态（如图2所示为菌丝形态）
观察，发酵效价检测，筛选性能稳定的优良菌种。

图2 斜面菌种、菌丝形态
1.3复筛（方法同初筛）
F2代斜面制备：将选出的初筛F1代斜面涂抹于空白斜面上，每支F1代斜面传3支F2代斜面。

1.4结果分析
研究表明，草帽型菌落的产抗能力均高于其他菌落。

故以挑选草帽型菌落为最佳[1-2]。

对经诱变处理、分离筛选获得的高产菌株进行产能及
效价测定，与出发菌株对照，结果显示：选育菌株性能明
收稿日期：2022-11-04
作者简介：李荣祎（1967—），男，甘肃庆阳人，本科，高级工程师，研究方向：生物工程、环境工程。

重离子束辐照阿维菌素菌种选育与发酵工艺优化
李荣祎
（核工业甘肃矿冶局，甘肃兰州 730030）
摘 要：利用重离子束辐照诱变阿维链霉菌（S.avermitilis）菌种，使菌种的遗传性状发生改变，然后通过分离筛选获得生产性能
稳定的优良菌株，并进行发酵培养基及条件优化试验，其摇瓶发酵效价达到了6000µg/ml，在1m 3、5m 3发酵罐上逐步放大试验研究，进一步优化工艺条件，5m 3发酵罐上连续3批发酵效价有效组分B1a 含量可达到4600µg/ml 以上。

关键词：重离子束；阿维菌素；菌种选育；发酵工艺；发酵效价 中图分类号：Q937
文献标识码：B
文章编号：1671-2064(2023)08-0166-03
图1 菌落形态
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显优于对照菌株，效价可达6000µg/ml 以上，主要活性成分AVMB1a 在产物中的所占比例明显提高，以此作为试验菌株传代培养，阿维菌素产能及有效组分基本稳定。

2.发酵培养基及工艺条件优化试验
根据菌种特性及生长营养要求，利用单因子试验法、
均匀设计原理，分析不同碳源、氮源及其配比对阿维菌素发酵单位的影响，以获得适宜的种子培养基和发酵培养基
配方，初步得出中试基本工艺控制参数，为放大中试及生产进一步优化工艺提供依据[2-3]。

长，在生长期内营养物质消耗过快，导致产抗营养不足，最终效价偏低；过长则接入发酵后，菌丝生长过快，容易使料液变黏稠，中后期营养物质利用慢，最终效价低。

故
将种龄控制在28h ～32h 为最佳。

2.2 主要碳源、氮源、无机盐及微量元素试验
2.2.1 主要碳源对发酵影响分析
选择不同的碳源类物质组成不同的培养基配方（总碳量保持一致），其他组成不变反复进行试验发酵，与对照组比对，结果如表2所示。

学术研究China Science & Technology Overview 以一定量的(NH4)2SO4作用最为明显，可以使产量提高10%；硝酸铵作为无机氮源时对于发酵效果无明显影响。

2.3 发酵工艺优化试验研究
利用FUS-50L发酵罐做控制工艺优化试验，接种种子摇瓶，培养24h左右，观察菌丝为网状分布时接入发酵罐，发酵罐投料30L，接种量为8%～10%。

通过多批次试验，对发酵过程温度、碳氮比、转速、通气比等进行优化，确定最佳工艺控制参数[3-4]。

2.3.1 不同温度条件下发酵效果对比
工艺参数持续优化的基础上，用高产菌株在5000L发酵罐
上进行了放大试验，连续生产3批发酵液B1a组份的含量
分别为4664μg/ml、4664μg/ml和4892μg/ml。

先后完成
中试连续生产10个批次，平均发酵周期260h，放料体积
4.0t，平均效价4600mg/L。

4.研究成果及应用前景
本项目研究了利用重离子辐照诱变阿维链霉菌菌株，
通过大量筛选获得了高产菌株，摇瓶发酵试验结果显示，
获取的正突变菌株产抗生素能力比出发菌株有一定程度的
(Gansu Bureau of Mining and Metallurgy, Nuclear Industry, Lanzhou Gansu 730030) Abstract:The use of heavy ion beam irradiation mutagenic S.avermitilis strains, so that the genetic traits of the strains changed, and then through isolation and screening, to obtain excellent strains with stable production performance, and fermentation medium and condition optimization test, the fermentation titer of the shaker bottle reached 6000 μg / ml, in the 1 m3, 5 m3 fermentation tank gradually enlarged test study, further optimize the process conditions, 5m3 fermentation tank on the three batches of fermentation titer effective component B1a The content can reach more than 4600 μg/ml. Key words:heavy ion beams;avermectin;breeding;fermentation process;fermentation potency
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