大肠杆菌基因工程人胰岛素课件
合集下载
基因工程制胰岛素(生工版)概述122页PPT
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
基因工程制胰岛素(生工版)概述
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
基因工程制胰岛素(生工版)概述
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
大肠杆菌生产人胰岛素
大肠杆菌生产人胰岛素基因工程自诞生以来发展很快。
1972年，美国斯坦福大学生物化学系主任贝格尔把两种病毒的DNA人工组合到一起，形成了第一个人工重组DNA分子，这是基因工程的开创性工作。
1973年，科恩发表一篇报告，说他们把大肠杆菌的两种质粒的DNA连接到了一起，并且又送回到大肠杆菌细胞中去，重组质粒的DNA得到了复制和表达。
这是第一次完成了一个基因工程。
1976年，美国用大肠杆菌生产出了本来由人脑产生的生长抑制素，完成第一个有实用价值的基因工程。
已知生长抑制素是含有14个氨基酸的多肽链，在清楚其结构以后，根据遗传密码可以倒推出它的基因结构——一条由42个核苷酸组成的DNA片断。
人工合成这个DNA片断，再把它送入大肠杆菌。
由这项研究开始，科学家又掌握了一条获得基因的新途径——人工合成。
使用类似方法，美国人在1978年又用大肠杆菌生产出了胰岛素，使胰岛素可以工业化生产，给糖尿病患者带来了福音。
原先胰岛素的来源是从牛胰脏提取，产量有限。
用化学方法人工合成胰岛素仅有科学意义而无实用价值，因为成本太高了。
现在世界医药市场上的胰岛素，已经大半是基因工程的产品了。
鼠生长激素、人生长激素、鸡卵清蛋白、人白细胞干扰素等许多种物质，也都已经可以用大肠杆菌生产。
生物制法：首先剪切胰岛素基因，再将胰岛素基因转入人的大肠杆菌内，再创造大肠杆菌裂殖的有利环境，对大肠杆菌进行大规模培养，使之产生大量的治疗糖尿病的药物——胰岛素。
基因制法: 在基因工程人胰岛素的生产过程中,一般是先表达胰岛素原,然后对胰岛素原复性,复性后的胰岛素原通过酶切得到有活性的胰岛素.其中胰岛素原的复性效率是决定最终收率的关键因素,正确折叠与错误折益胰岛素原的分子量完全相同,结构非常相似,采用RT-HPLC可对其进行分离检定. Sergeev等利用反相色谱建立了复性液中胰岛素原的检测方法.如果要对正确折叠与错误折盛胰岛素原的结构进一步说明,可将其用蛋白酶V8酶解,然后用RP-HPLC-MS作肤图谱.Damn等用S.aureus protease V8酶解胰岛素原,然后用R'FHPLC做肚谱图,并结合质谱法对重组胰岛素原的折受过程进行了监测.新胰岛素工艺提升市场超15% 行业格局将变(2009-05-22 10:57:54)糖尿病在过去十年里在全球各地发展势头十分迅猛，现在中国、印度、巴西和俄罗斯等新兴工业国也已迈入糖尿病高发国行列。
第十四章大肠杆菌基因工程ppt课件
3 核糖体结合位点
（2）核糖体结合位点对外源基因表达的影响
④起始密码子及其后续若干密码子的影响：
大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和 UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为 AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始 的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA的5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA 在核糖体上的准确定位。
全基因组测序，4405个ORF 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌基因工程
一、 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
2、大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
密码子与反密码子相互作用的自由能 行中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； 细胞内tRNA的含量
4 密码子
（2）密码子偏爱性对外源基因表达的影响
原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大
代半乳糖苷（IPTG）
底水平表达；诱导物可以使
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
1 启动子
启动子的可控性
➢乳糖启动子Plac的可控性（2）： cAMP
CAP
Plac上游附近拥有CAP结合区
，cAMP激活CAP，进而促进
最新[经济学]构建胰岛素基因工程菌幻灯片课件
![最新[经济学]构建胰岛素基因工程菌幻灯片课件](https://img.taocdn.com/s3/m/658ff5b61ed9ad51f11df28f.png)
E. coli GM2163 (dam- and dcm- )
BspE I
Sal I digest
the pepsinogen fragment was removed encoded E. coli ecotin
dephosphorylate and purify.
pEG-PI
E.coli BL21(DE3)Gold
重组人胰岛素
1.Humulin （优泌林）
Eli Lilly and Company
1982年10月在美国上市，全球第一 个商业化基因重组人胰岛素。
2.Novolin （诺和灵）
Novo Nordisk
欧洲市场的重组胰岛素类似物
重组人胰岛素类型1.重组前源自岛素Chain BChain C
6.E. Coli SF120
from Prof. George Georgiou’s laboratory
7.Bovine trypsinogen and thrombin
from Sigma
8.HisTrap FF crude and
from Amersham
HiTrap NHS-activated HP columns
Chain A
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac Met
转化
b-Gal
Apr Met
B peptide C peptide A peptide ori
人胰岛素原的cDNA
分离纯化
M
M
N
C
重组人胰岛素原
人胰岛素原表达法
表达产物的后处理路线：
B链中第22位上的Arg和第 R 29位上的Lys由于良好折叠
利用大肠杆菌生产胰岛素ppt课件
抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组 织利用葡萄糖增加。
（二）调节脂肪代谢
胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离 脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛 素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少， 分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化， 进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由 于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸 中毒。
容纳外来
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。
生产步骤
1.提取目的基因 2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生
1.提取目的基因
既从人的DNA中提取胰岛素基因,可 Nhomakorabea用限制性内切酶 将目的基
因从原DNA中分离。 1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行
剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分 子杂交，即DNA探针 2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序 4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商
（三）调节蛋白质代谢
胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白 质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有 利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作 用，必须有胰岛素的存在才能表现出来。因 此，对于生长来说，胰岛素也是不可缺少的激 素之一。
（四）其它功能
胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入 细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核 酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。
通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高 cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低， 加速糖原合成、抑制糖原分解。
（二）调节脂肪代谢
胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离 脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛 素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少， 分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化， 进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由 于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸 中毒。
容纳外来
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。
生产步骤
1.提取目的基因 2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生
1.提取目的基因
既从人的DNA中提取胰岛素基因,可 Nhomakorabea用限制性内切酶 将目的基
因从原DNA中分离。 1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行
剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分 子杂交，即DNA探针 2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序 4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商
（三）调节蛋白质代谢
胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白 质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有 利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作 用，必须有胰岛素的存在才能表现出来。因 此，对于生长来说，胰岛素也是不可缺少的激 素之一。
（四）其它功能
胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入 细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核 酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。
通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高 cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低， 加速糖原合成、抑制糖原分解。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
胰岛素AB链分别表达法的基本原理
人胰岛素原表达法
2 将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳 糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍 为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中 高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取 溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后 将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素 原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3 对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得 体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物 活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必 须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的 A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种 克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以 及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。 经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白， 再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融 合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程——人胰岛素202-2ppt课件
胰岛素AB链分别表达法的基本原理
小结
上述三种工程菌的构建路线均采用胰岛素或
胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基
1
4.5
因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达
率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含
2
5
体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白
分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原
3
3
编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的
大肠杆菌基因工程 —人胰岛素的生产
讲 述 人 599
小组成员
2016.11岛素的生产方法 3.产人胰岛素大肠杆 菌工程菌的构建策略
利用重组大肠杆菌生 产医用蛋白或多肽
由于大肠杆菌繁殖迅速价格低廉，培养代谢易于控制， 因此重组大肠杆菌在医用蛋白的大规模生产中具有重要 的经济意义。尽管有些生物活性严格依赖于糖基化作用 的真核生物功能蛋白无法用重组大肠杆菌进行生产，蛋 白质生物合成后加工系统的缺乏使得某些人体蛋白难以 折成天然构象，但仍有100多种异源蛋白通过大肠杆菌 基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂 的人体蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、 尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）、二硫键共 价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 以及四聚体的血红蛋白(Hb）等。
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
第二节 基因工程及其应用ppt课件
获得高产、稳产和具有 优良品质的农作物和具 有抗逆性的作物新品种。
转鱼抗寒基 因的番茄
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
精选PPT课件
37
2、基因工程与药物研制
许多药品的生产 是从生物组织中提取 的。受材料来源限制 产量有限，其价格往 往十分昂贵。
我国生产的部分基因 工程疫苗和药物
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工 业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导 入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但 能解决产量问题，还能大大降低生产成本。
目的基因 AATTCCGTAG
黏性末端
GGCATCTTAA
精选PPT课件
15
思考:
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有
相同的黏性末端？ 具有
不同的限制酶呢？
形成的黏性末端不同
精选PPT课件
16
（2006.台州质检）下列是由限制酶切割形 成的DNA片段，能用相应DNA连接酶将它们 恢复连接的组合是
精选PPT课件
41
转基因食品
安全吗?
精选PPT课件
42
课后
探究
课题：利用网络资源并结合教材中的 资料分析,就“转基因生物和转基因食品 的安全性”以小论文的形式发表个人见 解。
精选PPT课件
43
exercise
基因工程的正确操作步骤是:
①使目的基因与运载体结合 ②将目的基因导入受体细胞 ③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 ④提取目的基因
精选PPT课件
13
限制性内切酶（EcoRⅠ）作用 过程
精选PPT课件
点击播放
14
练习使用EcoRI 剪切目的基因
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAAGGGATT
重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达策略PPT教学课件
2020/12/12
SSP
2
生物技术制药 Biotechnology pharmceutical
基因工程主要步骤
获获
切
基
上游工程
接
转
因
增
工
检
程
下游工程
养
破
提
2020/12/12
纯
SSP
3
生物技术制药 Biotechnology pharmceutical
选择细胞
主要操作步骤
细胞培养
转化
筛选
细胞破碎
邵世鹏生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp周铁柱林立排名不分先后生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp上游工程下游工程生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp选择细胞细胞培养细胞破碎提取rna分离总mrnartpcr合成引物电泳连接转化筛选工程菌最佳培养条件探索一级培养发酵罐培养二级培养细胞破碎精纯检测包装生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp基于t7噬菌体rna聚合酶启动子大肠杆菌表达系统构建的可行性添加标签蛋白简并密码子偏好性探究目的蛋白的可控性表达蛋白酶缺陷菌株的构建分泌性表达的研究抗生素使用时机探究重组质粒的稳定性及对策工程菌的大规模高密度发酵探索生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三sspt7高速约为大肠杆菌的rna聚合酶5倍以上专一性只识别自己的启动子t7rna聚合酶对利福平有抗性高效目的蛋白占总蛋白25生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp生物技术制药biotechnologypharmceutical2018年1月24日星期三ssp
利用大肠杆菌生产胰岛素ppt课件
粒。
4.将质粒送回大肠杆菌
在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收.
将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性， 使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处 于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态）。
❖ 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高 cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降 低，加速糖原合成、抑制糖原分解。
❖ 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速 丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。
❖ 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖 异生。
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。
2.提取质粒
从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提 取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩 增、银染序列分析。 2.煮沸法
3.基因重组
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质
利用大肠杆菌生产胰岛素
基因工程育种
胰岛素作用机理
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯 一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。
4.将质粒送回大肠杆菌
在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收.
将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性， 使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处 于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态）。
❖ 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高 cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降 低，加速糖原合成、抑制糖原分解。
❖ 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速 丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。
❖ 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖 异生。
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。
2.提取质粒
从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提 取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩 增、银染序列分析。 2.煮沸法
3.基因重组
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质
利用大肠杆菌生产胰岛素
基因工程育种
胰岛素作用机理
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯 一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
然后组装在大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋 白经溴化氢CNBr处理后，分离传话A-B链多肽，然后再根据两条链连接 处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体 外折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺 陷仍是体外折叠的正确率较低，因此目前尚未进入应用阶段。
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
大肠杆菌基因工程人胰岛素
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程人胰岛素
AB链分别表达法
本次以重组人胰岛素为例，论述利用大肠杆菌生产外 大肠杆菌基源因工基程人因胰表岛素达产物的基本过程。
胰岛素的生产方法
人胰岛素是一种由两条多肽链 ( A 链和 B 链) 组成的蛋白 质。胰岛素合成时，最初在胰岛 B 细胞内的附着核糖体上形 成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后， 信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体， 在高尔基体中切除连接 序列( C 链) 形成 A 链和 B 链，然后 通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
小结胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基
1
4.5
因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达
率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含
2
5
体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白
分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原
3
3
编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的
大肠杆菌基因工程人胰岛素
胰岛素AB链分别表达法的基本原理
人胰岛素原表达法
2 将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳 糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍 为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中 高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取 溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后 将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素 原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3 对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得 体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物 活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必 须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的 A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
1 A链和B链的编码区由化学合成，两个双链
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种 克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以 及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。 经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白， 再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融 合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
虽然上述工艺路线并不比AB链 分别表达更为简捷，而且需要 额外使用两种高纯度的酶制剂， 但由于其体外折叠成功率相当 高，在一定程度上弥补了工艺 繁琐的缺陷，使得产品的生产 成本仅为50美元/g。
AB链同时表达法
3 这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，
大肠杆菌基因工程 —人胰岛素的生产
讲 述 人 599 小组成员
大肠杆菌基因工程人胰岛素
2016.11.7
目录
1.利用重组大肠杆菌 生产医用蛋白或多肽
2.胰岛素的生产方法 3.产人胰岛素大肠杆 菌工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程人胰岛素
利用重组大肠杆菌生 产医用蛋白或多肽
由于大肠杆菌繁殖迅速价格低廉，培养代谢易于控制， 因此重组大肠杆菌在医用蛋白的大规模生产中具有重要 的经济意义。尽管有些生物活性严格依赖于糖基化作用 的真核生物功能蛋白无法用重组大肠杆菌进行生产，蛋 白质生物合成后加工系统的缺乏使得某些人体蛋白难以 折成天然构象，但仍有100多种异源蛋白通过大肠杆菌 基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂 的人体蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、 尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）、二硫键共 价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 以及四聚体的血红蛋白(Hb）等。
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
大肠杆菌基因工程人胰岛素
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程人胰岛素
AB链分别表达法
本次以重组人胰岛素为例，论述利用大肠杆菌生产外 大肠杆菌基源因工基程人因胰表岛素达产物的基本过程。
胰岛素的生产方法
人胰岛素是一种由两条多肽链 ( A 链和 B 链) 组成的蛋白 质。胰岛素合成时，最初在胰岛 B 细胞内的附着核糖体上形 成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后， 信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体， 在高尔基体中切除连接 序列( C 链) 形成 A 链和 B 链，然后 通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
小结胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基
1
4.5
因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达
率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含
2
5
体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白
分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原
3
3
编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的
大肠杆菌基因工程人胰岛素
胰岛素AB链分别表达法的基本原理
人胰岛素原表达法
2 将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β-半乳 糖苷酶基因下游，两个DNA片段的连接处仍 为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中 高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采取 溴化氢化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后 将之进行体外折叠。由于C肽的存在，胰岛素 原在复性条件下能形成天然的空间构象，为3 对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得 体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物 活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必 须用胰蛋白酶特异性切除C肽，可获得完整的 A链以及C端带有精氨酸Arg的B链。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
1 A链和B链的编码区由化学合成，两个双链
DNA片段分别克隆在含有Ptac启动子和β-半乳 糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编 码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨 酸密码子。
重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种 克隆菌分别合成β-半乳糖苷酶-人胰岛素A链以 及β-半乳糖苷酶-人胰岛素B链两种融合蛋白。 经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白， 再用溴化氢在甲硫氨酸残基的C端化学切断融 合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
虽然上述工艺路线并不比AB链 分别表达更为简捷，而且需要 额外使用两种高纯度的酶制剂， 但由于其体外折叠成功率相当 高，在一定程度上弥补了工艺 繁琐的缺陷，使得产品的生产 成本仅为50美元/g。
AB链同时表达法
3 这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，
大肠杆菌基因工程 —人胰岛素的生产
讲 述 人 599 小组成员
大肠杆菌基因工程人胰岛素
2016.11.7
目录
1.利用重组大肠杆菌 生产医用蛋白或多肽
2.胰岛素的生产方法 3.产人胰岛素大肠杆 菌工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程人胰岛素
利用重组大肠杆菌生 产医用蛋白或多肽
由于大肠杆菌繁殖迅速价格低廉，培养代谢易于控制， 因此重组大肠杆菌在医用蛋白的大规模生产中具有重要 的经济意义。尽管有些生物活性严格依赖于糖基化作用 的真核生物功能蛋白无法用重组大肠杆菌进行生产，蛋 白质生物合成后加工系统的缺乏使得某些人体蛋白难以 折成天然构象，但仍有100多种异源蛋白通过大肠杆菌 基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂 的人体蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（HSA）、 尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）、二硫键共 价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 以及四聚体的血红蛋白(Hb）等。