细菌内毒素测定技术—鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验
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鲎试剂的规格指每支鲎试剂的装量，一般来说，规 格是多少，就用多少细菌内毒素检查用水复溶试剂使用 。在细菌内毒素检查的规定条件下使鲎试剂产生凝集的 内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表 示。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
（一）稀释标准内毒素 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准 品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、 0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管， 另外2管阴性对照（共18管）。37℃±1℃的恒温器中，保温60分 钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否 变形和滑落判断试验结果。 注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果 。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
一、鲎试剂及鲎试剂灵敏度
鲎血含铜蓝蛋白，呈蓝色。鲎试剂由鲎血制备而成 ，是从鲎血的变形细胞裂解物中提取制备而来。鲎试剂 根据鲎的种类不同科分为美洲鲎试剂、中国鲎试剂、圆 尾鲎试剂；根据鲎试剂和细菌内毒素反应的专一性不同 ，可分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
检查用水溶解的内毒素系列溶液的结在鲎试剂灵敏度复核范 围内时，试验方为有效。
知识点：干扰试验
分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终 点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成 的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）
Es=lg-1(ΣXs/4) Et=lg-1(ΣXt/4)
使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所 使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
知识点：干扰试验
用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品 按下表制备溶液A、B、C和D。同时制备2支供试品阴性 对照和2支阴性对照。
二、凝胶法干扰实验溶液的制备
知识点：干扰试验
三、结果判断： 当供试品阴性对照和水阴性对照都为阴性，并且细菌内毒素
3、结果判断： 若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照
管为阴性，试验方为有效。 4、结果计算：
反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。 λc=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
一、灵敏度复核的操作
1． 取分装有0. 1ml鲎试剂溶液的l0mm×75mm试管或复 溶后的0. 1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加 入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行 做4管；另外2管加入0. 1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照 。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃ 的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
2、将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人 37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
3、将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是 否变形和滑落判断试验结果。
注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果 。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
知识点：干扰试验
二、计算 按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素
的供试品溶液的内毒紊含量Ct计算该试验条件下的回收率（R）。
R (cs ct ) 100%
知识点：干扰试验
三、结果判断： 当内毒素的回收率在50％～200％之间，则认为在此试验条件
下供试品溶液不存在干扰作用。反之，须按“凝胶法干扰试验” 中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
（二）结果判断： 若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对
照管为阴性，试验方为有效。 结果计算：
反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc ）。
λc=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递 减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
若结果不是最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0. 25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性时,本批鲎试剂不能使用须查 找原因，可能是灵敏度表示错误，或是内毒素效价表示不 准确,或者操作失误,应重试。
知识点：干扰试验
当Es在0.5λ和2λ（包括0.5λ和2λ）之间、Et在0.5Es至2Es( 包括0.5Es和2Es）之间时，认为供试品在该浓度下无干扰作用 。应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干 扰试验。
三、光度测定法干扰试验
选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供 试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表制备溶液A、B、C和D。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
（一）稀释标准内毒素 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准 品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、 0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管， 另外2管阴性对照（共18管）。37℃±1℃的恒温器中，保温60分 钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否 变形和滑落判断试验结果。 注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果 。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
一、鲎试剂及鲎试剂灵敏度
鲎血含铜蓝蛋白，呈蓝色。鲎试剂由鲎血制备而成 ，是从鲎血的变形细胞裂解物中提取制备而来。鲎试剂 根据鲎的种类不同科分为美洲鲎试剂、中国鲎试剂、圆 尾鲎试剂；根据鲎试剂和细菌内毒素反应的专一性不同 ，可分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
检查用水溶解的内毒素系列溶液的结在鲎试剂灵敏度复核范 围内时，试验方为有效。
知识点：干扰试验
分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终 点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成 的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）
Es=lg-1(ΣXs/4) Et=lg-1(ΣXt/4)
使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所 使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。
知识点：干扰试验
用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品 按下表制备溶液A、B、C和D。同时制备2支供试品阴性 对照和2支阴性对照。
二、凝胶法干扰实验溶液的制备
知识点：干扰试验
三、结果判断： 当供试品阴性对照和水阴性对照都为阴性，并且细菌内毒素
3、结果判断： 若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照
管为阴性，试验方为有效。 4、结果计算：
反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。 λc=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
一、灵敏度复核的操作
1． 取分装有0. 1ml鲎试剂溶液的l0mm×75mm试管或复 溶后的0. 1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加 入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行 做4管；另外2管加入0. 1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照 。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃ 的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
2、将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人 37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
3、将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是 否变形和滑落判断试验结果。
注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果 。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
知识点：干扰试验
二、计算 按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素
的供试品溶液的内毒紊含量Ct计算该试验条件下的回收率（R）。
R (cs ct ) 100%
知识点：干扰试验
三、结果判断： 当内毒素的回收率在50％～200％之间，则认为在此试验条件
下供试品溶液不存在干扰作用。反之，须按“凝胶法干扰试验” 中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验。
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
（二）结果判断： 若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对
照管为阴性，试验方为有效。 结果计算：
反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc ）。
λc=lg-1（∑X/4）
式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递 减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程
若结果不是最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0. 25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性时,本批鲎试剂不能使用须查 找原因，可能是灵敏度表示错误，或是内毒素效价表示不 准确,或者操作失误,应重试。
知识点：干扰试验
当Es在0.5λ和2λ（包括0.5λ和2λ）之间、Et在0.5Es至2Es( 包括0.5Es和2Es）之间时，认为供试品在该浓度下无干扰作用 。应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干 扰试验。
三、光度测定法干扰试验
选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供 试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表制备溶液A、B、C和D。