醌介导染料脱色菌株的分离鉴定及特性

中国环境科学 2009,29(2)：191~195 China Environmental Science 醌介导染料脱色菌株的分离鉴定及特性

焦玲,吕红*,周集体,崔德涛,王竞(大连理工大学环境与生命学院,工业生态与环境工程教育部重点实验室,辽宁大连 116023)

摘要：实验分离获得1株能够利用醌化合物使磺酸化偶氮染料脱色的菌株JL,通过形态特征、16S rDNA与16S-23S区间序列分析表明,该菌株为蜡状芽孢杆菌(命名为Bacillus cereus JL).菌株JL使酸性大红3R脱色的最佳条件为葡萄糖浓度1g/L, pH值为5~7,温度30℃,接种量0.25g/L.蒽醌-2-磺酸(AQS)、蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)和2-羟基-1,4-萘醌(Lawsone)均能显著提高酸性大红3R的脱色速率,其中AQS 的促进作用最为明显.研究发现, 0.1mmol/L AQS能够使菌株JL对2.0mmol/L酸性大红3R保持较高的脱色速率,而且能使多种偶氮染料脱色,表现出较好的底物广谱性.利用高效液相色谱-质谱鉴定了AQS介导的酸性大红3R脱色产物,表明酸性大红3R的偶氮键发生断裂, AQS 在这一过程中仅起到电子传递的作用.

关键词：蜡状芽孢杆菌；偶氮染料；脱色；醌化合物

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2009)02-0191-05

Isolation, identification and characteristics of quinone compounds enhancing dye-decolorizing bacterium. JIAO Ling, LÜ Hong*, ZHOU Ji-ti, CUI De-tao, WANG Jing (Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, School of Environmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China). China Environmental Science, 2009,29(2)：191~195

Abstract：In the presence of quinone compounds, a strain (designated as JL) with the capacity to decolorize azo dyes was isolated. The strain was identified as Bacillus cereus JL based on morphological, 16S rDNA and 16S-23S spacer region sequence analysis. The optimal conditions for the decolorization of Acid Red 3R by strain JL were: 1g/L glucose, pH 5~7, 30℃, inoculation amount 0.25g/L. Anthraquinone-2-sulfonate (AQS), anthraquinone-2,6-disulfonate (AQDS) and 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (Lawsone) could improve the decolorization rate of Acid Red 3R,and AQS was most effective. Addition of 0.1 mmol/L AQS significantly increased the decolorization rate of 2.0mmol/L Acid Red 3R by strain JL,and the strain could decolorize other six azo dyes. According to the decolorization product of Acid Red 3R identified using HPLC-MS, strain JL could make cleavage for azo bond and AQS only acted as redox mediator in whole process. Key words：Bacillus cereus；azo dye；decolorization；quinone compounds

由于偶氮染料及其脱色产物芳香胺具有致畸、致癌、致突变作用,因此关于其降解的研究备受关注[1-3].生物降解法因具有反应条件温和、成本低、产生的污泥量少等优点,成为处理偶氮染料废水的首选方法[4-5].在印染废水处理中,普遍采用先厌氧后好氧的处理工艺,而菌株在厌氧阶段代谢缓慢,因此染料的厌氧脱色成为其生物降解的限速步骤[6-7].研究发现,外加一些蒽醌类化合物能够加速细菌对偶氮染料的脱色,并提出醌介导染料脱色的反应模型,认为细胞膜上的醌还原酶将醌还原为氢醌,氢醌再将电子传递给偶氮染料,从而使偶氮染料脱色[8-9].本课题组曾研究醌还原菌群利用醌氧化还原介质对偶氮染料脱色的强化作用[10-11],但未从单菌角度考察.本研究筛选分离出1株利用醌化合物使偶氮染料有效脱色的菌株,以期为深入研究醌介导的偶氮染料脱色机制提供一定理论基础.

1材料与方法

1.1实验材料

实验用活性污泥取自大连春柳河污水处理

收稿日期：2008-07-16

基金项目：国家自然科学基金资助项目(50578022)

* 责任作者, 讲师, lvhonghj@

192 中国环境科学 29卷

厂回流污泥池.采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法[12],从污泥样品中得到醌还原菌群.将其进行富集,经反复平板涂布,最终筛选出1株能使偶氮染料有效脱色的菌株.

菌株生长使用LB培养基组成为(g/L): NaCl 10, 蛋白胨10,酵母膏5.无机盐培养基组成为(g/L): NaCl 1, NH4Cl 1, K2HPO4⋅3H2O 0.2, MgSO4⋅7H2O 0.2, 葡萄糖1.固体培养基为LB培养基中加入2%琼脂.实验所用试剂: 蒽醌-2-硫酸(AQS), 蒽醌-2,6-二硫酸(AQDS), 2-羧茎-1,4茶硫(Lawsone).二丁基胺(色谱纯), 甲醇(色谱纯), 均购于SIGMA公司.实验所用染料:酸性红B,酸性大红3R,酸性大红GR,酸性苋菜红,活性艳红X-3B, 活性艳红K-2G均由大连理工大学化工学院染料合成实验室提供.

1.2菌株鉴定

1.2.116S rDNA的 PCR扩增及序列分析PCR引物采用细菌16S rDNA的一对通用引物[13].正向引物F8:5’-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3’;反向引物R1522:5’-AAGGACGT CATCCAGCCGCA-3’.PCR扩增体系总体积为25μL:超纯水16.2μL,10×PCR buffer 2.5μL, 10mmol/L dNTP 2μL,F27 引物1μL ,R1522引物1μL,Ex-taq 酶0.3μL,总DNA稀释10倍后取2μL.反应程序如下:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,上述步骤共进行30次循环,最后72℃延伸5min.PCR产物的测序由大连宝生物公司完成.

1.2.2系统发育树的构建将扩增获得的长度为1466 bp的序列在GeneBank核酸序列数据库中进行同源性比较,采用Mega 4.0软件进行多重序列比对分析,构建出系统发育树.

1.3菌株生长及对偶氮染料脱色的特性研究

1.3.1菌体生长的测量菌体干重x(g/L)与菌液吸光度OD660nm间存在线性关系.公式表达为: x=0.5254OD660nm－0.0142(R2=0.9943).

1.3.2染料吸光度和脱色率的测量反应液离心(8000r/min,10min) 后,以去离子水作为参比,使用紫外-可见分光光度仪(Jasco V-560, UV- VIS Spectrophotometer),测定染料最大吸收波长下的吸光度.脱色率(D)计算公式为:

100%

t

A A

D

A

−

=×

式中: A0为初始染料吸光度; A t为反应t时间后染料的吸光度.

1.3.3脱色产物分析将酸性大红3R脱色前和脱色后的样品在8000r/min下离心10min.上清液经过0.22μm膜过滤后,用于高效液相色谱-质谱(岛津,HPLC-MS 2010A)分析.流动相组成为甲醇、含有5mmol/L二丁基胺和乙酸的水溶液.色谱柱为Shim-pack VP-ODS (

2.0mm×200mm).液相检测器为DAD;质谱离子化方法为电喷雾离子化(ES);电离电压

3.5kV;离子源温度350℃;质谱检测模式为Full-scan;氮气流速5.0L/min.流动相洗脱程序为:

甲醇:水溶液(体积比为5/95) 5min;甲醇:水溶液(体积比为10/90)25mim;甲醇:水溶液(体积比为80/20) 25min.

2结果与讨论

2.1菌株的鉴定

图1 菌株JL形态的电镜照片(×5000) Fig.1 Morphology of strain JL by SEM(×5000)

菌株在固体培养基上形成的菌落呈圆形,边缘为锯齿形,菌落呈白色,形态较大(直径约为1cm).对该菌进行扫描电镜观察发现(图1),细胞呈杆状,无鞭毛,大小为[(0.7~1.0)×(1.6~4.0)]μm.通过测定16S rDNA序列并输入GeneBank运用BLAST软件进行同源性比较,结果显示,新菌与Bacillus cereus, Bacillus mycoides以及Bacillus thuringiensis的相似度为99%.对菌株16S-23S