喉鳞状细胞癌相关microRNA的筛选及功能鉴定

基金项目:辽宁省教育厅科学研究经费资助项目,项目编号:JYTQN2020018㊂
　作者简介:刘浩(1994),男,辽宁锦州人,在读硕士研究生,主要研究方向为喉癌方面研究㊂
　通讯作者:宫亮(1980),男,辽宁锦州人,副教授,硕士学位,主要研究方向为喉癌的诊疗工作㊂
喉鳞状细胞癌相关microRNA 的筛选及功能鉴定
刘浩,穆兰,黄志伟,杨瑞明,宫亮
(锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州121000)
摘要:目的　采用生物信息学技术及第二代RNA 测序技术检测喉鳞状细胞癌相关microRNA ,通过筛选及功能鉴定,为喉癌特定且有意义的靶向基因治疗提供依据㊂方法　临床收集3组经术后病理证实为喉鳞状细胞癌患者的喉癌与癌旁组样本,并应用第二代RNA 测序技术检测喉癌及癌旁组织中miRNA 的表达情况㊂采用生物信息学技术,对差异表达miRNA
进行分层类聚分析及筛选;随机选取1种差异的表达的miRNA (miR-106a-5p ),采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR )验证miR-106a-5p 在30例喉癌及癌旁组织中的表达水平㊂结果　3组喉癌及癌旁组织样本经第二代RNA 测序,共检测到1624种miRNA ;经过火山图及聚类分析共得到显著差异表达的miRNA 44种,其中表达上调21种,表达下降23种;经过qRT-PCR 结果显示,miR-106a-5p 在30例喉癌组织样本中表达水平(5.71±1.65),显著高于癌旁组织(2.66±0.87),差异具有统计学意义(P <0.05)㊂结论　通过生物信息学方法筛选出喉癌差异表达miRNA ,其中miR-106a-5p 在喉癌组织的表达水平明显高于癌旁组织,与第二代测序结果一致㊂
关键词:miR-106a-5p ;喉鳞状细胞癌;第二代测序;高通量分析
中图分类号:R739.65 文献标志码:A 文章编号:2096-305X (2021)02-0040-05
Screening and Functional Identification of microRNA Related to Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Liu Hao,Mu Lan,Huang Zhiwei,Yang Ruiming,Gong Liang
(The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000China)
Abstract :Objective　To detect microRNAs associated with laryngeal squamous cell carcinoma with bioinformatics technology
and second-generation RNA sequencing technology and to provide a basis for specific and meaningful targeted gene therapy for larynge⁃al carcinoma through screening and functional identification.Methods　Samples of laryngeal carcinoma and paracancer tissues from 3groups of patients with laryngeal squamous cell carcinoma confirmed by postoperative pathology were collected clinically,and the ex⁃pression of miRNA in laryngeal carcinoma and paracancer tissues were detected by second-generation RNA sequencing technology.The differentially expressed miRNAs were analyzed and screened by stratified classification and clustering by means of bioinformatics tech⁃niques.One differentially expressed miRNA (miR-106a-5p)was randomly selected,and the expression level of miR-106a-5p in 30cases of laryngeal cancer and adjacent tissues was verified by real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR).Re⁃
sults　A total of 1624miRNAs were detected in 3groups of laryngeal cancer and paracancer tissue samples by second-generation RNA sequencing;a total of 44miRNAs with significantly different expressions were obtained by volcano map and cluster analysis,among which 21were up-regulated and 23were down-regulated.QRT-PCR results showed that the expression level of miR-106a-5p in 30laryngeal cancer tissues was (5.71±1.65),significantly higher than that in adjacent tissues (2.66±0.87),with statistically signifi⁃cant difference (P <0.05).The results are identical with those detected by the second-generation sequencing.Conclusion　Through
the combined use of next -generation RNA sequencing technology and bioinformatics methods,a large number of differentially ex⁃pressed miRNAs were successfully screened from laryngeal cancer tissues,providing a basis for further research on the relationship be⁃tween miRNA and the phenotype of laryngeal cancer.
Key words :miRNA-106a-5p;laryngeal squamous cell carcinoma;second-generation sequencing;high throughput analysis
喉鳞状细胞癌(laryngal squamous cell carcino⁃ma,LSCC)是头颈部第二大常见的恶性肿瘤,仅
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次于鼻咽癌,病因至今仍不十分明了,其发生可能与吸烟㊁饮酒㊁病毒感染㊁放射线㊁性激素等因素有关㊂目前LSCC的治疗方式主要是手术切除肿瘤结合放疗和化疗[1]㊂尽管治疗技术有所提高,但LSCC的生存率并没有显著提高[2]㊂因此迫切需要寻找新的喉癌靶向治疗,以延长患者的生命并提高患者的生存质量㊂
第二代测序技术又称下一代测序技术(next generation sequencing,NGS),是近年来新兴的一项比较成熟的转录组学测序技术,可同时对数以百万的基因进行序列测序并筛选差异表达的基因㊂miRNA是一类大小为19~25个核苷酸组成的非编码小RNA分子,通过结合mRNA的3'端,导致mRNA沉默或降解影响其表达水平㊂研究表明miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关㊂大量研究表明[3-4],miRNA在喉癌的发生发展中起着重要的调控作用㊂本研究通过第二代测序技术与生物信息学方法的结合,并通过qRT-PCR在临床样本上去验证去筛选差异表达的miRNA,并期望对喉癌的临床诊断㊁治疗及预后提供重要信息㊂1　材料与方法
1.1　材料
研究样本:临床收集2019年1月至2020年10月就诊于锦州医科大学并接受手术治疗的33例患者的喉癌组织及癌旁组织(>0.5cm),所有患者在行手术前均未接受过放疗和化疗等治疗方式㊂所有标本切除后取部分喉癌及癌旁组织(与肿瘤安全界>0.5cm),迅速放入液氮中并转-80℃冰箱保存㊂病理采集过程及后续实验均得到知情者同意以及医学伦理委员会批准,且为患者签署保密协议㊂
主要试剂:TRIzol试剂㊁反转录试剂盒(In⁃vitrogen,美国);miRNeasy Mini Kit(总RNA抽提试剂盒,Qiagen,德国);RNA Nano6000检测试剂盒㊁SYBRGreenPCR试剂盒(罗氏公司);文库制备试剂盒(Illumin,美国);miR-106a-5p引物购自北京擎科生物科技有限公司㊂仪器:分光光度仪(NanoPhotometer,美国);核酸样品分析仪(Agilent Bioanalyzer2100,美国);第二代DNA测序系统(Illumina Hiseq4000,美国);实时定量PCR检测仪(Roche Light CyclerTM480,瑞士)㊂1.2　方法
1.2.1　RNA提取及质量鉴定
　取喉癌及癌旁组织样本各20mg,按照TR⁃Izol和miRNeasy Mini Kit试剂盒提供的说明书要求提取总RNA,应用NanoPhotometer分光光度仪对提取的总RNA进行纯度及浓度检测,使用Agilent Bioanalyzer2100系统的RNA Nano6000检测试剂盒评估RNA完整性㊁质量及分布㊂
1.2.2　miRNA测序文库的制备与测序
随机抽取3例患者的喉癌组织及癌旁组织的总RNA进行cDNA文库的建立和测序㊂每个样本总RNA量为3μg用于下一代测序实验,采用Illumi⁃na的NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set 制备cDNA文库㊂将获得的小RNA文库在生物分析仪(Agilent,High Sensitivity DNA Kit)上进行定量,合并,并使用3%凝胶BluePippin HT(Sage Science)提取适当范围的cDNA片段(140~160 bp)㊂文库最终长度范围在安捷伦Bioanalyzer2100 (Agilent)上用高灵敏度DNA试剂盒进行验证,仅包含部分微小RNA㊂最后用第二代DNA测序系统(Illumina Hiseq4000)对构建获得的cDNA文库进行测序,获取的信息通过计算机进行分析,并对微小RNA序列进行解码和注释[5]㊂
1.2.3　差异miRNA的生物信息学分析
首先使用Cutadapt软件修剪并去除质量评分较低的碱基序列和测序得到的序列3′和5′接头,并去除短17bp的修剪序列㊂然后对剩余序列质量进行验证(FastQC软件),进而初步完成对数据的筛选㊂然后用miRDeep2v2.0.0.7软件的quantifier.pl 模块[6]和SeqBuster软件的miraligner[7]使用默认参数,以前体和成熟miRNA序列作为参考,对过滤后的reads进行miRNA和isomiRNA定量(miRBase v21)㊂利用 DESeq2”R中实现的负二项广义线性模型,对3组喉癌和癌旁样本中的miRNA进行差异表达的分析,以P<0.05且log2(fold change, FC)>1判定为表达具有显著差异性㊂通过绘制火山图展现喉癌组织中有显著性差异表达的miRNA,以红点表示喉癌组织中表达显著上调,绿点表示表达显著下降;取差异表达明显的miRNA,通过绘制聚类分析热图,展现miRNA在不同组织样本中的表达情况,红色代表高表达,蓝色代表低表达㊂通过绘制维恩图,展现筛选出的miRNA在喉癌与癌旁组织的分布情况㊂
1.2.4　qRT-PCR
随机挑取1种差异表达明显的miRNA(miR-106a-5p),采用qRT-PCR检测miR-106a-5p在30例喉癌及癌旁组织中的表达水平,并对比二代测序结果㊂将30组提取好的总RNA,按逆转录试
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刘浩,等:喉鳞状细胞癌相关microRNA的筛选及功能鉴定
剂盒合成cDNA,然后进行qRT-PCR,反应条件为:95℃60s㊁95℃10s㊁60℃15s(40个循环)㊂本反应以U6snRNA为内参基因,应用7500
System SDSSoftware软件,统计ΔΔCt值,并以2-ΔΔCt值代表miR-106a-5p的表达水平㊂引物序列见表1㊂
1.3　统计学方法
采用SPSS25.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(⎺x±s)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05表示差值具有统计学意义㊂
表1　引物序列
基因引物序列(5′-3′)
miR-106a-5p上游CGCGAAAAGTGCTTACAGTG
下游AGTGCAGGGTCCGAGGTATT U6上游TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG
下游GTGCAGGGTCCGAGGT
2　结 果
2.1　RNA抽提结果
经NanoPhotometer分光光度仪检测结果显示,喉癌及癌旁组织中抽提获得的RNA的D260nm/ D280nm值均为1.8~2.1,说明提取的总RNA有较好的纯度㊂经过Agilent Bioanalyzer2100检测结果显示,RNA的RIN值≥6,数据表明提取的总RNA具有较好的完整性㊂样本提取的RNA总量≥3μg,具备二代测序的要求㊂
2.2　差异表达miRNA的可视化分析
本次测序共检测到1624种miRNA,其中差异表达明显miRNA的共44种,其中23种在喉癌组织中显著下调,21种在喉癌组织中显著上调㊂miRNA的差异表达见火山图1,聚类分析热图见图2,miRNA在喉癌及癌旁的分布情况见维恩图3㊂2.3　qRT-PCR结果及验证
在46种差异表达明显的miRNA中随机抽取1种(miR-106a-5p),其二代测序结果显示在喉癌组织中表达上调,见表2㊂qRT-PCR检测结果, miR-106a-5p在30例喉癌组织中的表达水平为(5.71±1.65),癌旁组织中的表达水平为(2.66±0.87),差异具有统计学意义(P<0.05),与二代测序结果一致,见图
4㊂
绿点表示显著下调,红点表示显著上调,蓝点表示无明显差异
图1　火山图
表2　癌组织及癌旁组织中miR-106a-5p表达水平
分组n miR-106a-5p表达水平P
癌组织305.71±1.65
癌旁组织302.66±0.87<0.05
3　讨 论
第二代测序技术为分析miRNA的生物学信息研究提供了新的思路,它可同时分析miRNA的表达水平和序列变化[8]㊂与其他需要使用预先设计的探针的微阵列或qRT-PCR方法不同,第二代测序技术可以识别分析样本中存在的所有miRNA分子,而不受新的miRNA和新序列亚型[9]的影响㊂miRNA是一种短链非编码小RNA,通过与转录本[10]中的互补序列结合抑制蛋白编码基因的表达㊂虽然关于miRNA的所有生物学功能尚未明确,但已有研究表明,miRNA可以调控至少一半的人类蛋白编码基因的表达,包括致癌基因和抑癌基因[11-12]㊂因此,应用第二代测序技术去研究发掘差异性表达的miRNA,并为临床治疗提供有价值的生物靶点具有重要的临床意义㊂
本研究通过第二代测序技术与生物信息学方法的结合方法,从3组喉癌及癌旁组织中共筛选出1624种miRNA,其中差异表达明显的miRNA共有44种,23种在喉癌组织中表达显著下调,21种在喉癌组织中表达显著上调㊂经过qRT-PCR验证表明,miR-106a-5p在30组喉癌组织的表达水平明显高于癌旁组织,与二代测序结果一致㊂虽然此次
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测序成功筛选的miRNA 并不多,而且显著差异性表达的miRNA 占比比较少,但是它们潜在的临床价值是非常巨大的㊂譬如我们经过qRT-PCR 验证并筛选的miR-106a-5p 已经在相关肿瘤性疾病中进行了大量的研究㊂研究表明,miR -106a -5p 在肺癌[13]㊁卵巢癌[14]中高度表达,并促进癌症细胞的增殖及迁移,然而在肾癌[15]中表达下调,并通过调控VEGFA 抑制癌症细胞的增殖及迁移㊂然而关于miR-106a-5p 与喉癌的相关性分析尚不明确,有待于进一步实验去研究㊂
喉鳞状细胞癌的发生与发展是复杂而多变的病
理过程㊂而miRNA 在机体的生长㊁细胞凋亡㊁分化㊁代谢和肿瘤性疾病的发生发展中均展现了强大的调控能力㊂因此提高miRNA 与喉癌之间的发病机制的认知尤为重要㊂本次实验二代测序及qRT-PCR 验证的样本相对较少,且筛选出差异性表达明显的miRNA 并不多,将来可以投入更大量的样本中去筛选㊁验证有价值的miRNA㊂
综上所述,应用二代测序技术去筛选疾病相关
miRNA 是一条高效率且快捷的途径,为探索喉癌的分子机制提供了重要思路,也为临床寻找新的生物靶点奠定了基础
㊂
红框代表高表达,蓝框代表低表达,Tumor 代表喉癌组,Normol 代表癌旁组
图2　聚类分析热图
3
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差异miRNA 分布情况,VPT 代表喉癌组,VPN 代表癌旁组
图3　
维恩图
图4　miR-106a-5p 在30组喉癌及癌旁组织的表达水平
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收稿日期:2021-01-12
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